UPLC法同时测定三白草中7种木脂素类成分的含量

胥爱丽，江洁怡，毕晓黎，陈伟韬，李养学，李素梅，段福先

[广东省中医药工程技术研究院(广东省中医药研究开发重点实验室)，广东 广州 510095]

三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill，又名水木通、五路白、白水鸡、白黄脚、三点白、白叶莲等，为三白草科三白草属植物，以干燥地上部分入药，具有清热解毒、利尿消肿之功效，用于治疗小便不利、淋沥涩痛、带下或尿路感染、肾炎水肿，外治疮疡肿毒、湿疹等症[1]。三白草在我国南方分布广泛，资源十分丰富。据研究报道，三白草含有挥发油、木脂素类、黄酮类、生物碱类化合物[2-4]。

在前期研究中，本课题组对三白草的抗病毒活性成分进行了筛选，结果发现三白草中的木脂素类成分为抗病毒的主要活性成分，并从三白草中提取分离得到了三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B等7种活性成分单体。目前，现行版《中国药典》已收载了三白草中三白草酮的质量分数测定方法，但仅测定了1个指标成分，而文献报道的三白草质量控制方法多是针对其中的黄酮类成分[5-6]，尚未有全面控制木脂素类成分的研究报道。因此，本文旨在建立一种同时测定三白草中多个木脂素类活性成分质量分数的方法，以便更全面、更有针对性地控制三白草药材的质量，为该药物的临床应用及进一步的研究开发奠定基础。

1 仪器与材料

Agilent 1290超高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器(美国)；KQ-700DE数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；TLE204十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-6恒温水浴锅(北京精科华瑞有限公司)；CIENTZ-30F冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；ALB-200高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)；Milli Pore Advantage A10自动纯水机(美国)。

三白草酮(自制，质量分数99.51%)、三白草醇(自制，质量分数97.60%)、Saurucinol I(自制，质量分数96.50%)、里卡灵A(自制，质量分数99.10%)、4-O-去甲基马钠萨亭B(自制，质量分数98.52%)、马钠萨亭B(自制，质量分数95.20%)、里卡灵B(自制，质量分数99.80%)，质量分数均采用液相色谱法进行测定，峰面积归一法计算；甲醇[色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

33批三白草批号及产地来源见表1，均经广东省中医药工程技术研究院刘法锦教授鉴定为三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。

表1 33批三白草样品信息Table 1 Sources of Saururus chinensis (Lour.) Baill.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：AdvanceBio Peptide Plus C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%H3PO4(B)，梯度洗脱(0～3 min，45%～59%A；3～15 min，59%～60%A；15～17 min，60%～70%A；17～25 min，70%～75%A；25～30 min，75%～100%A；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B适量，加甲醇配制成含三白草酮179.04 μg/mL、三白草醇39.55 μg/mL、Saurucinol I 26.27 μg/mL、里卡灵A 48.02 μg/mL、4-O-去甲基马纳萨亭B 37.03 μg/mL、里卡灵B 48.14 μg/mL、马纳萨亭B 48.16 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取三白草粉末(过四号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min(功率700 W，频率25 kHz)，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适应性试验

按“2.2”项下方法制备供试品溶液和混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果三白草中7种木脂素类成分的分离度和理论塔板数均符合要求，三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B的分离度分别为2.39、4.15、2.98、1.52、18.29、2.15、4.77，理论塔板数分别为27 507、19 675、17 799、28 952、235 755、166 675、212 084。色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液各0.1、1、2、4、6、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得不同质量浓度的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，以进样量为横坐标，各峰面积值为纵坐标，分别算得标准曲线的回归方程和相关系数，结果见表2。

2520151050-52520151050-512435123456677101520255ABt/minmAUmAU

1.三白草酮; 2.三白草醇; 3. Saurucinol I; 4.里卡灵A; 5. 4-O-去甲基马纳萨亭B; 6.里卡灵B; 7.马纳萨亭B。

图1三白草样品(A)与混合对照品(B)的超高效液相色谱图

Figure1UPLC chromatograms of sample (A) and control (B)

表2 7种木脂素类成分的线性关系考察结果Table 2 The linear relationship of seven lignans components

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(S1)2 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果测得三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B峰面积的RSD值分别为0.25%、0.64%、0.84%、0.46%、1.08%、0.59%、0.67%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液(S1)，分别在0、3、6、9、12、24 h各进样1次，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果测得三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B峰面积的RSD值分别为0.23%、0.30%、0.97%、0.47%、1.10%、0.39%、0.64%，均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品(S1)，按照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件下分别进样，测定峰面积并计算质量分数。结果测得三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B的平均质量分数分别为3.472 5、0.223 2、0.213 4、0.364 3、0.222 3、0.371 4、0.221 3 mg/g，其RSD值分别为0.44%、1.58%、0.69%、1.12%、2.57%、1.22%、1.92%，均小于2%，表明方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量同一批次的三白草样品(S1)9份，每份0.5 g，精密称定，分别加入7种成分相应的对照品溶液1、2、3 mL(三白草酮0.870 5 mg/mL，三白草醇0.056 1 mg/mL，Saurucinol I 0.053 5 mg/mL，里卡灵A 0.091 3 mg/mL，4-O-去甲基马萨纳亭B 0.055 7 mg/mL，里卡灵B 0.091 3 mg/mL，马萨纳亭B 0.055 5 mg/mL)，挥干溶剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算加样回收率，结果见表3。

2.9 7种木脂素类成分质量分数的测定

取不同批次三白草样品，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下色谱条件进行质量分数测定，以干燥品计算三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-去甲基马萨纳亭B、里卡灵B、马萨纳亭B的质量分数，结果表4。

表3 7种木脂素类成分的加样回收率试验结果Table 3 The results of the recovery determination of seven lignans components

表3 (续)

表4 33批三白草药材木脂素类成分的质量分数测定结果Table 4 The content of lignans in 33 batches Saururus chinensis (Lour.) Baill.(n=2) w/(mg·g-1)

表4 (续)

3 讨论

从本研究结果可见，三白草中三白草酮质量分数较高；不同产地三白草中，7种木脂素类成分的质量分数存在差异，其中云南产地(S32)的三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-去甲基马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B的质量分数均较高，影响三白草中木脂素类成分质量分数大小的因素可能与药材生长的环境(光照、气候、土壤等)有关，同时，药材采收时节，干燥方法、贮存和养护条件等因素也可能有影响。

本研究分别比较了用甲醇、80%甲醇、50%甲醇、90%乙醇、50%乙醇5种溶剂进行超声提取的效果，结果显示以采用甲醇提取的效果较好；在此基础上比较了回流提取和超声提取的效率，结果显示2种提取方法无明显差异，因此选择操作较方便的超声提取。另外，比较了超声时间和固液比对提取效果的影响，结果显示超声30 min、固液比为1∶50时，三白草中的7种木脂素成分基本能够提取完全。

采用DAD二极管阵列检测器对样品及对照品进行全波长扫描，结果显示7种木脂素成分在230 nm附近均有最大吸收，因此选定230 nm为检测波长。分别试验了甲醇-水、甲醇-甲酸、甲醇-冰醋酸、甲醇-磷酸4种流动相系统，以及不同流动相比例，并考察了不同浓度磷酸水溶液对7种木脂素成分色谱行为的影响。结果表明，以甲醇-0.1%磷酸作为流动相为佳，各成分的色谱峰均能达到基线分离，且峰形对称。

本研究建立的同时测定三白草中三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡灵A、4-O-去甲基马纳萨亭B、里卡灵B、马纳萨亭B质量分数的UPLC法，方法快速、简便、准确、可靠，可用于三白草药材木脂素类成分的质量控制，为三白草的进一步深入研究和开发利用提供了技术支持。