UHPLC-MS-MS法同时测定疏肝安神颗粒中的5种活性成分

张诚光，毕晓黎，胥爱丽，陈昭

[广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东 广州 510095]

抑郁、失眠等精神疾病对身心健康产生严重影响，由于不易察觉、诊断标准模糊及易突发严重后果等特点，通常需要长期服用药物控制症状[1-2]。中医将抑郁归为肝气郁结、心神不宁、痰浊血淤等，治疗以疏肝理气、祛瘀化痰为主，注重调理机体、脏器，循序渐进改善精神状况[2-3]。

疏肝安神颗粒系广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)中药制剂，由醋北柴胡、白芍、香附、丹参、茯苓等药味经现代化制剂工艺制作而成。该制剂有疏肝理气、祛瘀化痰、安神定志等功效，可用于治疗中风后抑郁、失眠气郁、痰郁、血郁之证[4]。目前，疏肝安神颗粒已建立了包括含量测定在内的医疗机构制剂质量标准；同时，包括君药柴胡在内的主要药味的药理活性、化学成分、质量标准等已有研究报道[5-9]；在此基础上，本研究基于其功效主治，进一步建立UHPLC-MS-MS同时测定多种活性成分的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo TSQ Quantum超高效液相色谱-质谱联用仪(美国Thermo-Fisher公司)；METTLER XS205DU型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo)；KQ5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MilliPore Advantage A10自动纯水机(美国MilliPore公司)。

1.2 材料

柴胡皂苷A(批号：110777-201510)、柴胡皂苷D(批号110778-201510)、丹参酮ⅡA(批号：110766-201721)、丹酚酸B(批号：111562-201716)、芍药苷(批号：110736-201741)对照品均购自中国食品药品检定研究院；茯苓酸A(批号F-024-180525)和茯苓酸B(批号：F-035-180525)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；样品处理及LC-MS分析用甲醇、甲酸、乙腈等试剂为HPLC级别，购自德国Merck公司；去离子水为自制。

疏肝安神颗粒，批号分别为20170501、20170502、20170701、20170702、20170802、20170901、20180301、20180501、20180701、20180901，广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)制剂室生产。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得每1 mL含柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芍药苷、茯苓酸A、茯苓酸B对照品分别为10、10、10、80、50、0.2和1 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取疏肝安神颗粒适量，研细，取约0.25 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声30 min，取出，放冷，称定质量，加甲醇补足减失质量，所得溶液以0.22 μm微孔滤膜过滤，精密吸取滤液100 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得供试品溶液。

2.3 LC-MS条件

液相色谱条件：色谱柱为Phenomenex C18(2.1 mm×50 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脱(0～0.5 min，5%～45%A；0.5～1.0 min，45%～45%A；1.0～1.5 min，45%～95%A；1.5～2.5 min，95%～95%A；2.5～3.0 min，95%～5%A)；流速为0.7 mL/min；进样量为10 μL。

质谱扫描条件：采用ESI离子源，正负离子同时扫描，全部离子对均为SRM模式；喷雾电压3 500 V，雾化室温度350 ℃，离子传输管温度300 ℃，鞘气压力206.843 kPa，辅气压力68.948 kPa，各离子对(即各组分的母离子和碎片离子)检测条件见表1。所得疏肝安神颗粒混合对照品及供试品离子流图见图1。

由测定结果可知，供试品中无柴胡皂苷D和丹参酮ⅡA质谱峰，故后续方法学考察和多批次样品测定中未列入上述化合物。

表1 疏肝安神颗粒各成分质谱检测参数Table 1 Mass Detection parameters of the active components for Shugan Anshen Granules

1.总离子流图； 2～8.分别为茯苓酸B、茯苓酸A、芍药苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的提取离子流图。

图1疏肝安神颗粒各组分对照品(A)和供试品(B)的LC-MS离子流图
Figure1LC-MS ion current of standard (A) and sample (B) solutions for Shugan Anshen Granules

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液100、50、20、10、5、2、1 μL，置于不同10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，制得柴胡皂苷A质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL，丹酚酸B质量浓度为0.08、0.16、0.4、0.88、1.6、4.0、8.0 μg/mL，芍药苷质量浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL，茯苓酸A质量浓度为0.0002、0.0004、0.001、0.002、0.004、0.01、0.02 μg/mL，茯苓酸B 质量浓度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 μg/mL的系列溶液。吸取上述溶液，按“2.3”项下LC-MS条件分析，记录各组分离子流图和峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，所得各组分回归方程及相关系数(r2)见表2。可见，方法线性良好，在浓度线性范围内可以对疏肝安神中的各活性成分进行准确测定。

2.4.2 精密度试验 取同一批次疏肝安神颗粒(批号20170802)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下LC-MS条件重复进样6次，记录各组分离子流图和峰面积，计算峰面积的RSD值，结果显示各组分峰面积的RSD在0.40%～1.98%范围内，表明方法精密度良好，见表3。

表2 各组分的回归方程Table 2 The regression equations for each component

表3 精密度、稳定性、重复性考察结果Table 3 Results of precision,stability and repeatability tests

2.4.3 稳定性试验 取同一批次疏肝安神颗粒(批号20170802)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下LC-MS条件分别在0、2、4、6、8、12 h进行分析，记录各组分离子流图和峰面积，计算峰面积的RSD值，结果显示RSD值在0.57%～2.44%范围内，表明供试品溶液在12 h内稳定，见表3。

2.4.4 重复性试验 取同一批次疏肝安神颗粒(批号20170802)，共取6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下LC-MS条件分析，记录各组分离子流图和峰面积，计算各组分质量分数的RSD值，结果显示各组分质量分数的RSD值在0.35%～2.70%范围内，表明方法重复性良好，见表3。

2.4.5 加样回收率试验 取同一批次疏肝安神颗粒(批号20170802)，共取9份，每份0.2 g，精密称定，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例精密加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件记录各组分离子流图和峰面积，计算各组分质量分数、回收率及其RSD值，结果见表4。可见，各组分的回收率在95.45%～103.86%范围内、RSD值在0.76%～4.20%范围内，表明方法准确度良好。

2.5 10批疏肝安神颗粒5种活性成分的测定

取10批疏肝安神颗粒，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下LC-MS条件分析，记录各组分离子流图和峰面积，计算各组分的质量分数，结果见表5。

表4 各组分回收率试验结果Table 4 Results of sample recoveries of each component (n=3)

表5 10批疏肝安神颗粒质量分数测定结果

Table5The results of determination for Shugan Anshen Granules (n=2)w/(mg·g-1)

批号柴胡皂苷A丹酚酸B芍药苷茯苓酸A茯苓酸B201705010.3123.0582.5510.0110.068201705020.3503.4872.5240.0120.065201707010.3723.9012.5660.0110.065201707020.2823.9382.5270.0080.066201708020.3654.0412.5300.0100.064201709010.2564.2762.5150.0120.063201803010.3624.2792.5180.0100.063201805010.3014.4012.4940.0110.082201807010.3414.3532.5550.0090.062201809010.3074.3682.5320.0110.066

3 讨论

参考中药质量标志物的筛选原则与方法，基于有效、足量、可测的原则，本研究选取了柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、芍药苷、茯苓酸A、茯苓酸B等7个成分作为测定指标。文献报道显示，上述7种成分来自疏肝安神颗粒中的君药柴胡和臣药赤芍、茯苓，具有较好的疏肝益气、安神解郁功效[8,10-13]，对上述成分建立同时LC-MS测定方法，可以较好地评价疏肝安神颗粒的质量。经预实验发现，供试品中并未检测到柴胡皂苷D和丹参酮ⅡA的明显信号，故该2种成分未列入最后的检测指标。

在建立分析方法过程中发现，柴胡皂苷A和柴胡皂苷D离子对一致，难以通过质谱进行区分，为保证检测准确并提高总体分析效率，经过对色谱条件反复优化，可知当流动相极性处于中等极性阶段时(40%～60%)，二者分离度较好；最终，本研究选择了将乙腈比例迅速升至45%后，保持约0.5 min，实现了对柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的基线分离。究其原因，可能是二者虽分子量相同，但结构差异导致极性差别较大，在色谱柱中洗脱顺序不同，因此可以通过二者色谱行为(保留时间)的差异进行区分；此外，由于柴胡皂苷D极性较柴胡皂苷A低，常见以水煎液为基础制备的各类含柴胡的方剂中，较难检测到柴胡皂苷D。

本研究选取疏肝安神颗粒中多个与功效主治相关的成分为指标，进行筛选和含量测定研究，采用LC-MS法同时测定相较传统方法效率、灵敏度和准确度更高，为后续深入研究该制剂的作用机理和功效物质基础提供了科学参考。