间接免疫荧光法检测抗核抗体对干燥综合征诊断价值的meta分析

2019-09-10张敏杰高玉芳徐晓莉罗文强

国际检验医学杂志 2019年17期

张敏杰，高玉芳，徐晓莉，罗文强

(咸阳市中心医院医学检验科，陕西咸阳 712000)

干燥综合征(SS)是一种主要累及外分泌腺体的慢性系统性炎症性自身免疫病，典型临床表现为以外分泌腺淋巴细胞浸润为特征的口眼干燥[1]。疾病进展期间，患者可出现各种系统性的临床病变，如疲劳、关节炎、皮肤血管炎、血液病、肺间质疾病、肾衰竭、周围神经和中枢神经病变、胃肠道疾病。因此，SS被认为是一种异常的自身免疫性疾病，具有广泛器官特异性及系统性临床症状，同时出现伴随多种散在并发症的血清学异常[1-2]。各种不同的临床症状造成临床对SS的诊断率较低。最新的临床研究显示疾病早期采用利妥昔单抗进行治疗可提高唾液腺功能，减轻疲劳，减少腺体外器官受累症状[3-4]。这说明在对相关器官和组织造成不可逆的损伤之前，早期进行疾病鉴别诊断的重要性。自身抗体检测已经成为诊断SS的标准之一，4种自身抗体抗-Ro/SSA抗体、抗-La/SSB抗体、抗核抗体(ANA)和类风湿因子(RF)在临床上应用广泛，其阳性率与SS不同临床症状之间具有相关性。自身抗原Ro/La核糖核蛋白复合物抗体抗-Ro/SSA抗体、抗-La/SSB抗体是在SS患者中最常见的抗体。50%～70%的原发性SS患者可检出抗-Ro/SSA抗体和抗-La/SSB抗体[5]。抗-Ro/SSA抗体可单独检出，也可与抗-La/SSB抗体同时检出，但是，单独抗-La/SSB抗体阳性较少见[6]。抗-Ro/SSA抗体和抗-La/SSB抗体阳性患者更年轻、病程更长、外分泌腺功能紊乱更严重且更易复发腮腺增大，同时可累及较小的唾液腺[7-8]。有研究显示，抗-Ro/SSA抗体和抗-La/SSB抗体阳性SS患者腺体外器官受累症状更为普遍，主要包括脾肿大、淋巴结病、脉管炎和雷诺现象等[9]，且抗-Ro/SSA抗体和抗-La/SSB抗体会在疾病进展过程中持续存在[10]。研究表明，抗-Ro/SSA抗体和抗-La/SSB抗体对SS诊断特异度较高，但灵敏度较低，仅为25%～50%，对于腺体外临床表现(如雷诺现象、皮肤脉管炎和肾脏受累等)明显的阴性患者，需要进一步进行唇腺活检以明确诊断，患者依从性差。且在SS患者中，使用不同的检测方法抗-Ro/SSA抗体和抗-La/SSB抗体灵敏度和特异度差别较大。ANA抗原位点包括细胞核内核酸、组蛋白、非组蛋白、磷脂、各种蛋白酶及细胞质中各种细胞器，抗-Ro/SSA抗体靶抗原为细胞质小分子核糖核蛋白颗粒，抗-La/SSB抗体靶抗原为细胞核小分子核糖核蛋白颗粒，采用间接免疫荧光法检测ANA，其荧光染色模型多为核颗粒型。59%～85%的原发性SS患者可采用间接免疫荧光法检出ANA[11]，多见于女性SS患者，诊断平均年龄低于男性。原发性SS患者出现ANA阳性与病变范围及受累器官多少存在相关性，同时高丙种球蛋白血症患病率也更高[12]。由于SS引起的器官损害具有不可逆性，因此，SS诊治的难点在于早期诊断，唇腺病例活检为有创性检查，损伤较大。早期唇腺病理改变具有非特异性，且诊断方法灵敏度低，限制了其在SS早期诊断中的作用。近年来ANA被广泛应用于自身免疫性疾病及SS的诊断，结果不甚一致。本研究通过收集ANA用于SS诊断的研究数据，并进行meta分析，旨在明确ANA对诊断SS的特异度及灵敏度，综合评价ANA对SS的诊断价值。

1 材料与方法

1.1文献来源计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI)、万方科技期刊全文数据库、中国生物医学文献检索数据库(CBM)和维普中文科技期刊全文数据库(VIP)中公开发表的采用间接免疫荧光法检测SS患者血清中ANA的研究，检索时限均从建库至2018年10月。中文检索词为“干燥综合征”“自身免疫性疾病”“结缔组织病”“抗核抗体”或“自身抗体”。同时以“sjögren′s syndrome (SS)”“anti-nuclear antibody (ANA)”“connective tissue disease(CTD)”“dryness symptoms”“autoimmune diseases (AID)”及相关同义词联合检索PubMed、EMbase、Medline、The Cochrane Library外文数据库。手工检索其他相关文献及纳入研究的参考文献，以补充获取更多文献，具体筛选过程见图1。

1.2文献纳入与排除标准纳入标准，(1)研究类型：国内外已发表评价血清ANA检测对SS诊断价值的研究。(2)研究对象：SS患者。诊断依据：根据唇腺组织病理检查证实、美国欧洲共识小组(AECG)修订SS诊断标准或美国风湿病学会(ACR)诊断标准进行诊断。除此之外，临床诊断均可作为诊断依据。(3)方法：待评价试验为以选择Hep-2细胞作为抗原的间接免疫荧光法检测ANA，结果判断以抗体滴度≥1∶100为阳性。(4)结局指标：合并灵敏度、合并特异度、合并阳性似然比、合并阴性似然比、合并诊断优势比、绘制汇总受试者工作特征(SROC)曲线并计算曲线下面积(AUC)。

排除标准：(1)采用非间接免疫荧光法检测ANA的研究。(2)原始研究纳入病例为SS合并其他自身免疫病的患者。(3)研究中纳入病例≤20例的研究。(4)无法获取四格表数据或者数据有明显错误的研究。(5)同一研究者或者研究单位对同一人群进行的重复研究或重复发表、重复收录的研究。

1.3文献筛选、资料提取和质量评价由2位研究者独立筛选文献并提取资料，对纳入文献进行偏倚风险评价，随后进行结果对比，存在争议的文献由第3位研究者和第4位研究者协商决定。提取资料主要包括第一研究者、发表年份、时间范围、研究对象所在国家、病例的诊断方法、纳入对照的类型及病例与对照总数、性别、年龄。四格表数据真阳性(TP)、假阳性(FP)、假阴性(FN)、真阴性(TN)。采用质量评价工具(QUADAS-2)进行偏倚风险评价，QUADAS-2工具由4个部分组成，(1)病例的选择；(2)待评价诊断试验；(3)金标准；(4)病例流程和进展情况。由2位研究者独立使用QUADAS-2工具对所有研究进行评价，结果所得一致性较好。其他信号问题的评判标准、偏倚风险和适用性判断解释见表1。

图1 文献筛选流程及结果

表1 QUADAS-2应用偏倚风险和适用性判断解释

1.4统计学处理采用meta-Disc 1.4软件进行meta分析，首先分析各研究间的阈值效应，计算灵敏度的对数与1-特异度的对数并行Spearman相关系数检验，P<0.05提示存在阈值效应。运用meta-Disc 1.4软件进行异质性分析，计算诊断优势比(DOR)的Cochran-Q值，I2值检验异质性。P>0.05，I2<50%则无统计学异质性，采用固定效应模型合并效应量。当P<0.05，I2>50%为存在统计学异质性，采用随机效应模型合并效应量包括：合并灵敏度、合并特异度、合并阳性似然比、合并阴性似然比、合并诊断优势比，拟合SROC曲线并计算AUC。采用meta回归分析异质性来源，采用Stata12.0软件绘制Deek′s漏斗图非对称检验评估是否存在发表偏倚，P<0.05为差异有统计学意义，表明存在发表偏倚。

2 结果

2.1文献检索结果及纳入研究的基本情况 2位研究者分别按照检索策略检索相关数据库，初检共获得相关文献436篇，通过阅读相关参考文献补充获取文献3篇。通过阅读摘要排除重复文献和不相关文献，初步筛选后获得文献235篇。阅读全文后根据排除标准分析文章内容和数据的完整性及正确性，排除相关文献后，共计16项研究最终纳入meta分析。纳入研究的基本信息见表2。

表2 纳入研究的基本特征

2.2纳入研究的基本特征和偏倚风险评价本研究共纳入16项研究，包含SS患者851例，对照2 858例。对照类型包含非自身免疫性疾病患者、自身免疫性疾病患者、原发性胆汁性肝硬化患者、非结缔组织病患者及健康者。病例选择过程中有1项研究采用随机法纳入病例[15]，3项研究连续纳入病例[14,20,28]。1项研究采用盲法检测病例和对照ANA[28]，除5项研究外11项研究均明确说明ANA检测以选择Hep-2细胞作为抗原基质的间接免疫荧光法[17,19,22-23,26]。11项研究结果判断以抗体滴度≥1∶100为阳性[13,15-16,19-23,26-28]；Hayashi研究最小稀释滴度为1∶40，本研究录入四格表数据是稀释滴度为1∶160的结果，同样Op de beeck的研究四格表数据也是稀释滴度为1∶160的结果。有5项研究对ANA阳性结果进行荧光模型分析[15,18-20,25]。以AECG诊断标准或ACR标准为病例诊断标准的研究有11项，3项研究以1993年欧洲初始标准为诊断方法[13-15]，1项研究未对病例的诊断标准进行详细阐述[19]，1项研究诊断标准为“自身免疫性疾病诊断标准”[25]。由于SS属于慢性疾病，短期的时间间隔不会产生高风险偏倚，笔者设定时间范围≤3年为恰当的时间间隔。所有原始研究均无失访者或遗漏病例。采用QUADAS-2工具进行偏倚风险评价及适用性判断，结果见图2。

2.3meta分析结果

2.3.1ANA对SS的诊断价值评估纳入的16项研究包括SS病例851例，对照2 858例。Spearman相关系数为r=0.421(P=0.104)，提示定量评价无阈值效应，采用随机效应模型进行meta分析，结果显示：合并灵敏度为0.76(95%CI:0.73～0.79)，见图3；合并特异度为0.90(95%CI:0.89～0.91)，见图4；合并阳性似然比为9.54(95%CI:4.24～21.46)，合并阴性似然比为0.28(95%CI:0.13～0.61)；合并诊断优势比为36.39(95%CI:14.16～93.47)；AUC为0.90，见图5。

注：PS为病例的选择；IT为待评价试验；RS为金标准；FT为病例流程和诊断试验与金标准之间的时间间隔

图2纳入研究的偏倚风险评价

2.3.2异质性检验非阈值效应引起的异质性检验结果显示，纳入16项研究DOR对应的Cochran-Q=146.22 (P=0.000 0),I2=89.7%；meta分析纳入的研究间均存在高度异质性。从临床角度结合纳入研究的特征按照以下因素进行meta回归分析，寻找异质性来源：地区(分为“中国组”和“国外组”)；剔除2项滴度不详研究，滴度(分为“≥1∶100”组和“<1∶100”)；剔除3项时间范围不详研究，时间范围(分为>3年组和≤3年组)；对照类型分为“疾病患者”组和“健康者”组。结果发现“对照类型”是造成异质性的可能原因。剔除对照类型为疾病患者的6项研究后发现异质性得到改善[14,18,22,25,27-28]，DOR对应的Cochran-Q=28.15,I2=68.0%；剔除对照类型为疾病患者的研究后合并灵敏度降低为0.74(95%CI：0.70～0.78)，合并特异度为0.94(95%CI：0.93～0.95)，合并阳性似然比为13.10(95%CI：9.02～19.01)，合并阴性似然比为0.27(95%CI：0.09～0.81)，合并诊断优势比为63.38(95%CI：29.42～136.53)，AUC为0.97。合并特异度、合并诊断优势比、AUC均较高，异质性明显降低。

图3 ANA诊断SS合并灵敏度的meta分析

图4 ANA诊断SS合并特异度的meta分析

图5 ANA诊断SS的SROC曲线

2.3.3灵敏度分析和发表偏倚将大样本或者结果差异较大的研究剔除后再次进行meta分析，结果无变化，说明本研究稳定性好，结果可信。采用线性回归的方法检验是否存在发表偏倚，绘制Deek′s漏斗图，结果纳入16项研究斜率系数的P值=0.381，无明显发表偏倚，见图6。

图6 ANA诊断SS发表偏倚漏斗图

3 讨论

SS是一种可以累及全身的自身免疫性疾病，因个体差异大，疾病诊断较困难。其诊断标准自1986年来经历了多次的发展和演变。2002年由美国欧洲小组联合修订了之前的欧洲标准共同制定了“2002美国欧洲共识标准”，具有较高的诊断价值而取得了广泛应用。2012年，由美国风湿病学会推荐了新的ACR标准，其中血清学指标中新添加的ANA≥1∶320并RF阳性仍具有较高的特异度。对于一些早期还未出现干燥性角结膜炎，唇腺活检尚未发现阳性但血液中出现特异性抗体的SS患者，该条目能够减少这类患者的漏诊。目前，SOLOMON等[29]提出ANA对系统性红斑狼疮(SLE)和系统性硬化症(SSc)诊断效果较好，对于SS诊断效果较一般。JEONG等[30]最新研究结果显示，采用间接免疫荧光法法检测ANA对于这3种疾病总体诊断效果相同(SLE灵敏度为95.2%，SSc灵敏度为93.6%，SS灵敏度为88.4%)。GONZALEZ等[31]的研究显示，筛选酶免疫分析法(SEIA)检测ANA对SLE的诊断灵敏度为61.8%，而间接免疫荧光法为76.5%，该研究采用1∶160作为临界值可能是造成间接免疫荧光法诊断灵敏度较低的主要原因。LEUCHTEN等[32]研究显示，采用间接免疫荧光法检测ANA对SLE进行诊断，以1∶40为临界值灵敏度为98.4% (95%CI:97.6%～99.0%)；以1:160为临界值灵敏度为95.8%(95%CI:94.1%～97.1%)。本文通过对纳入的16项研究进行meta分析，计算合并诊断效应量、拟合SROC曲线评价ANA对SS的诊断效能，通过分析研究间异质性来源，查找可能影响研究结果的因素，最后通过灵敏度分析和检测发表偏倚评估本研究的可信度。结果显示,16项研究采用间接免疫荧光法对SS患者及对照中ANA进行检测，合并灵敏度为0.76，合并特异度为0.90，合并DOR为36.39，AUC为0.90。表明ANA对SS诊断价值较高。本文纳入的16项研究间存在高度异质性(I2=89.7%)。经Spearman相关系数检验，异质性与阈值效应无关，进一步进行meta回归，试图寻找异质性的可能来源。结果显示，地区、抗体滴度、时间范围均不是异质性的来源，说明试验设计的差异不会造成研究结果的明显变化。然后，将“对照类型”作为协变量进行meta回归分析，发现剔除对照类型中包含疾病患者的研究后合并灵敏度降低(0.74)、合并特异度(0.94)、合并DOR(63.38)、AUC(0.97)均较高，且异质性明显降低(I2=68.0%)，表明对照类型的选择可能是导致异质性的原因之一。为了判断本研究的稳定性，以每次剔除1篇文献的方法进行灵敏度分析。结果显示，每次剔除1篇研究后，合并DOR均未发生明显变化，提示本文受单个研究的影响较小，分析结果稳定可靠。本文纳入的一些原始研究存在不足之处，大部分研究在病例选择过程中未能进行随机或连续纳入，这就不可避免地存在潜在偏倚；除1项研究外其他研究均未采用盲法对ANA进行检测；所有研究均为病例-对照研究，由于研究者事先明确诊断分组，ANA检测试验基本是在知晓临床诊断的情况下开展的，因此会影响到试验结果的判读，很可能会夸大诊断的准确性。本研究还存在不足之处，尽管本研究广泛地收集关于ANA诊断SS的相关文献，但仅限于中、英文，尚未对中英文之外文献数据库进行检索，因此,不可避免地存在出版偏倚和其他类型偏倚。SS诊断常有赖于临床表现口干、眼干主观性项目的评价及相关客观检查如唇腺活检及自身抗体测定，由于SS诊断相对困难，本研究纳入的文献除部分文献符合病理诊断标准外其余都是采用不同版本诊断标准诊断SS，甚至部分文献未对诊断标准进行明确阐述。不同的诊断标准可能会对研究结果产生偏倚，因此更合理可靠的结果还需要更多高质量的研究来补充和完善。