液相色谱系统梯度延迟体积测算方法

李泓文，聂大林

（苏州赛谱仪器有限公司，江苏 苏州 215200）

0 引言

赛谱仪器的SCG 蛋白纯化系统是液相色谱仪器（LC）中的一种，基本原理和HPLC 类似，本文介绍的梯度延迟体积测算方法将搭配赛谱仪器SCG 蛋白纯化系统中的UV 检测器使用。该检测器为光二极管阵列检测器（Diode Array Detector，DAD），波长范围200nm ～800nm，可同时检测4 个波长，它采用钨灯与氘灯组合光源，从光学上把两个光源结合在一起，复合光经衍射光栅色散后投射到1024 个二极管组成的二极管阵列上被检测，其光路图如图1 所示。

本次测算的对象是北京卫星制造厂在科技部重大专项《高精度超高压液相泵的开发与应用》（项目编号：2016YFF0101000）项目中研制的高精度超高压液相泵（UHPLC-BSC-02 型），以及SCG 蛋白纯化系统中的色谱泵。

1 梯度洗脱

进行高效液相色谱分析时，常采用两种洗脱方式，一种为等度洗脱（isocratic elution），另一种为梯度洗脱（gradient elution）[1]。

用等度洗脱进行色谱分离，由不同溶剂构成的流动相组成，如流动相的极性、离子强度、pH 等，在分离的全过程中皆保持不变。用梯度洗脱进行色谱分离时，在洗脱过程中含两种或两种以上不同极性溶剂的流动相组成会连续或间歇地改变，期间可调节流动相的极性，改善样品中各组份间的分离度。梯度洗脱一般是指流动相组成随分析时间的延长呈线性变化，即线性梯度洗脱[1]。

梯度系统可分为低压梯度系统和高压梯度系统，不同系统的延迟体积取决于泵的设计。低压梯度系统通过控制比例阀的开闭时间，而高压梯度系统通过控制泵的流量实现梯度洗脱[3]。在四元低压梯度系统中梯度混合在比例阀处进行，在混合器、管路、比例阀均相同的条件下，该阀造成的延迟体积通常比二元高压梯度系统的延迟体积更大，本文测试均为高压梯度系统。

2 梯度延迟体积及影响

色谱分离效果受色谱系统等诸多因素影响，尤其在不同设备之间复制梯度洗脱方法时可能会表现出明显差异。

梯度延迟体积是色谱系统的重要特征参数，是指从溶剂配比完成点到色谱柱头的系统体积，主要来源是泵、压力传感器、混合器以及连接管路。

实际观测到的梯度洗脱会向后平移一段时间，称为梯度洗脱的延迟时间，如图2（a）所示。在梯度洗脱开始与结束处的轮廓线理论上应为直线，但实际上由于梯度系统中的延迟体积导致系统内扩散，直线则变成了圆滑的线，这就使梯度洗脱的线性变差如图2（b）所示[1]。

图2 线性梯度轮廓Fig.2 Linear gradient profile

图3 二元高压梯度系统中的梯度延迟体积Fig.3 Gradient delay volume in a binary highpressure gradient system

传统HPLC 系统延迟体积一般在0.5mL ～5mL 范围，通常采用4.6mm 内径，150mm 或更长的色谱柱，分析时间10min ～20min 之间或更长时，延迟体积影响并不显著。但是随柱长变短，内径变细，较大的延迟体积可能会引起保留时间明显增加，色谱分离情况发生变化。因此，应选延迟体积小的液相色谱仪以适应梯度试验，二元高压梯度系统中延迟体积如图3 所示[2]，四元低压梯度系统中的梯度延迟体积如图4 所示。

梯度方法开始后，在梯度溶液通过延迟体积前色谱柱内的流动相尚未改变。在此期间，色谱柱处于等强度洗脱过程中，在不同设备间复制梯度洗脱方法时需要谨慎。即便是在同一根色谱柱上用相同的方法操作色谱过程，延迟体积如果有变化，样品保留时间很可能也会改变。除此之外，较小的延迟体积也有利于色谱系统快速更换溶剂，同时更适于梯度洗脱。

图4 四元低压梯度系统中的梯度延迟体积Fig.4 Gradient delay volume in a quaternary low-pressure gradient system

1）环境条件：环境温度18 ℃～30 ℃，环境湿度≤75%。

2）流动相：A 二次蒸馏水，B0.4%丙酮。

3） 设 备： 泵1 套，UV 检 测 器1 套，1/16PFA 管*15cm，注射器1 支，精密天平1 台。

3 梯度延迟体积测算

3.1 测算原理

大多液相色谱系统从流动相开始至色谱柱柱头会有泵、压力传感器、混合器、样品选择模块、进样模块、背压阀、排空阀、过滤器等。计算其内部腔体体积及管路，接头体积非常复杂，且所有部件的加工精度误差实际存在且无法被有效计算，在超高压系统下可能还需将压力因素考虑在内。已知的直接称重法、使用非保留化合物法、同位素标记淋洗液中组份法、局部干扰法，无机盐法以及同族线性化法均不能可靠测量延迟体积[4]。

本方法先将连接至色谱柱柱头的管路直接连接至赛谱仪器SCG 蛋白纯化系统的UV 流通池，使用0.4%丙酮溶液泵入系统直至充满并得到吸光度V1，再用流动相选择阀将流动相切换至纯水，冲出系统内的0.4%丙酮溶液直至吸光度归零，同时用注射器收集此阶段所有混合液并称量质量M，然后将混合液再次泵入系统直至吸光度稳定至V2，最后使用测试过程中得到的V1，V2 和M 计算出0.4%丙酮溶液的质量即可算出从流动相选择阀开始至色谱柱柱头的全部体积，流动相选择阀至泵入口的管路因为是在泵前几乎不受压力的影响可以直接根据管路长度和内径计算出该段体积并扣除，剩下部分即为延迟体积。本方法排除了上述的机械加工误差以及高压因素的影响，在UV 检测器线性范围内均能准确测量延迟体积且方法灵活，可以根据实际需要增加或减少被测管路和部件，例如在不扣除泵前管路的情况下即可算出样品加载体积。

图5 梯度延迟体积测算方法示意图Fig.5 Schematic diagram of the gradient delay volume measurement method

3.2 操作步骤

◇正确连接仪器后开机，检测器波长设置为254nm，预热0.5h。

◇流动相选择阀CTR 连接进样泵，S1 连接二次蒸馏水，S2 连接0.4%丙酮溶液，泵出液口连接检测器流通池，流通池出液口连1/16PFA 管*15cm。

◇流动相选择阀通道选择S2，手动运行流速5ml/min，确认管路充满丙酮溶液且无气泡，待UV 吸光度平稳后记录一段平稳的吸光度平均值V1。

◇将注射器清洗干净并擦干后放置于精密天平，待数值稳定后按下“去皮”按钮，数值显示为零后取回注射器备用。

◇取下1/16PFA 管，排出液体后重新接回，并将PFA管出液口连接至注射器。

◇流动相选择阀通道选择S1，手动运行流速5ml/min，待注射器中收集混合液（管路中剩余的丙酮溶液+通道S1的二次蒸馏水）约10ml 时暂停，将注射器放置于精密天平，记录天平显示值M。

◇取回注射器，将流动相选择阀S1 通道连接注射器，手动运行流速5ml/min，待UV 吸光度平稳后记录一段平稳的吸光度平均值V2。

◇重复以上步骤3 次，将V1，V2，M 值填入表1 得出加载体积L，并计算L 的平均值作为加载体积。图5 为方法示意图。

式（1）中，ρ——丙酮溶液和二次蒸馏水混合液密度，默认为1。

表1 赛谱仪器液相泵延迟体积计算Table 1 Calculation of liquid phase pump delay volumeof game Sepure Instrument

3.3 测算结果

本方法原理与梯度准确度测试原理相似，在泵流速和UV 检测器线性良好的前提下，使用本方法对赛谱仪器液相泵和国产高精度超高压液相泵的梯度延迟体积进行测算，结果见表1 和表2（以下体积数据均已扣除泵前管路0.456ml）。

4 结论

通过将国产高精度超高压液相泵与赛谱仪器液相泵分别用该方法测算梯度延迟体积，从测算结果可知该梯度延迟体积测算方法具有良好的重复性，且根据实际情况可以用于大多数液相系统的延迟体积、泵死体积、样品泵加载体积、柱外死体积等测量。

表2 国产高精度超高压液相泵延迟体积计算Table 2 Delay volume calculation of domestic high-precision ultra-high pressure liquid pump