青花菜BoMYB基因的克隆与序列分析

项展恺

摘   要：通过培养青花菜幼苗并提取DNA，以所得DNA为模板克隆青花菜MYB基因，并对该基因进行测序。测序后，利用生物信息学手段进行序列分析，包括寻找同源序列、同源序列蛋白质翻译比对、分析翻译所得蛋白质的理化性质和二级结构，预测结构域和构建系统发育树。从青花菜中克隆得到的BoMYB基因，其编码263个氨基酸，蛋白序列中具有2个SANT结构域。对比在拟南芥中的研究推测，该基因可能在渗透胁迫响应中起作用。系统发育分析结果表明，BoMYB与欧洲油菜的MYB聚为一组，它们与拟南芥的MYB处于不同分支。对BoMYB基因的克隆与序列进行分析，为探究青花菜MYB基因的表达、功能及抗逆机理研究奠定了基础。

关键词：青花菜;MYB基因;克隆;序列分析

文章编号： 1005-2690（2019）01-0112-03       中图分类号： S635.3       文献标志码： B

青花菜（Brassica oleracea var. italica），又名西兰花、绿花菜，是市场上常见的蔬菜之一，浙江台州是我国的青花菜主产地，建有全国最大的青花菜生产中心，是当地菜农出口创汇的重要蔬菜作物。植物在生长发育过程中，經常会受到外界不良环境的影响，如干旱、水涝、病虫害等，导致生长受阻。青花菜也一样，在整个生育期中受多种因子的胁迫，引起产量和品质下降，最终影响菜农的收入。

MYB转录因子是植物中最大的转录因子之一，其不仅在调节植物次生代谢[1]、细胞分化、细胞周期[2]以及叶片等器官形态建成中发挥作用，还在植物生长发育及抗逆境胁迫过程中起着极其重要的作用，如拟南芥AtMYB2受ABA诱导表达，并与RdBPI蛋白相互作用协调Rd22的表达，从而提高植物的抗逆境能力[3]等。当植物受到干旱、低温等非生物因素胁迫时，会诱导MYB转录因子的表达，并通过结合相应的顺式作用元件，激活并调控下游基因的表达，从而对植物的抗逆能力产生影响[4]。但在青花菜中，尚未有关MYB转录因子存在的报道。

本研究尝试在提取青花菜叶片DNA的基础上克隆青花菜BoMYB基因，利用生物信息学手段分析其序列特征及与同源序列的差异，预测该基因的生物学功能，为探究青花菜MYB基因的功能奠定基础。

1   材料与方法

1.1   植物样本与试剂

1.1.1   植物样本

试验材料为青花菜“优秀”品种，培育于人工气候箱，2叶1心时从植株上采集叶片用于DNA的提取。

1.1.2   主要试剂

使用“新型植物基因组DNA快速提取试剂盒”，试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。dNTPs购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2   方法

1.2.1   DNA提取

提取青花菜DNA的步骤为：在1.5 mL离心管中加入450 μL溶液A，然后加入β-巯基乙醇至浓度为0.5%;取两片同一株青花菜的叶子，设为A和B叶片;将A叶片撕成几片，放入研钵A中;打开液氮瓶，将适量液氮倒入研钵A中，并用研棒研磨叶片;待液氮完全消失后，观察叶片是否已完全成粉末状;将研磨好的粉末A加到以上预备好的离心管中;对于叶片B，重复以上步骤;粉末A分别放入标记的离心管1和离心管2;粉末B分别放入标记的离心管3和离心管4;将离心管1、2、3、4，65 ℃水浴30 min（期间每隔10 min轻轻颠倒混匀样品一次）;水浴完成后，加入5 μL RNase，混匀，37 ℃水浴1 h;再加入400 μL溶液B，充分混匀，常温下放置5 min，再用高速冷冻离心机于12 000 rpm离心5 min;用500 μL氯仿抽提一次;将上清液用移液枪转移到一个新的离心管中，加入600 μL异丙醇，充分混匀，室温放置10 min。12 000 rpm离心10 min，小心去除上层清液;加入600 μL去除溶液C，颠倒混匀两次，用枪头轻轻吹打沉淀，12 000 rpm离心5 min，弃废液;于室温敞盖放置20 min（至无明显乙醇味）;加入80 μL溶液D（相应离心管中即为基因组DNA溶液）;取5 μL 于1%的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。5 min后，弃废液;于室温敞盖放置20 min（至无明显乙醇味）;加入80 μL溶液D（离心管中即为基因组DNA溶液）。

1.2.2   PCR扩增

采用上游引物（5'-ATGGCGGATCGTATTA-3'）、下游引物（5'-CTACTCGATTCTTCCAACT-3'）进行PCR扩增，引物由上海生工合成。PCR反应体系共20μL，2μL 10×buffer（含20 mmol/L  Mg2+），DNA模板0.8 μL，上/下游引物（20 μmol/L）各0.3μL，0.5μL dNTPs（10 mmol/L）（上海生工），0.4 μL Taq DNA聚合酶（2 U/μL）（北京鼎国），不足的部分加ddH2O补充。反应在Bio-Rad S1000型PCR仪上进行，PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，32个循环;最后72 ℃延伸10 min。将克隆的BoMYB基因送上海生工测序，获得目的序列。

1.2.3   序列分析

对测得的青花菜MYB基因序列进行序列分析，利用NCBI数据库的在线工具BLAST寻找同源序列;利用Clustal X进行BoMYB及其同源序列的多序列比对;进化树构建采用MEGA5.05;登陆http：//smart.embl-heidelbery.de/，预测结构域;登陆https：//web.expasy.org/protparam/和https：//web.expasy.org/protscale/，预测蛋白质理化性质;登陆https：//www.predictprotein.org/，利用PSIPRED在线工具进行蛋白质二级结构的预测。

2   结果与讨论

2.1   青花菜BoMYB基因的扩增

利用PCR扩增得到的青花菜BoMYB基因长度约为950 bp，与预期结果大小基本一致，条带单一、清晰、明亮，说明PCR扩增成功，可用于后续的测序和分析。

2.2   青花菜BoMYB基因序列分析

测序结果表明，BoMYB的基因组全长为903 bp，具有一个内含子，长度为111 bp，两个外显子的长度分别为369 bp和423 bp。BoMYB的编码区全长为792 bp，编码263个氨基酸。

通过BLAST进行同源序列比对，得到8条同源序列，利用Clustal X和GeneDoc，对BoMYB基因及其同源序列的编码蛋白进行多序列比对。

同源序列比对结果表明， 1-110，166-171、175-185、252-273、284-305等位点高度保守，但序列中也存在一些残基的不同，这些位点可能具有功能性价值;BoMYB与其同源序列相比，129-165位点缺失，63、118、221、231、233、285、286、293等位点有新的氨基酸出现。

系统发育树结果表明，该基因与BoMYB和欧洲油菜（B. napus）聚为一支，拟南芥（Arabidopsis thaliana）超級家族基因和小盐芥（Eutrema salsugineum）聚为一支。BoMYB和欧洲油菜BnMYB亲缘关系最近，推测可能有与该类蛋白具有相似的功能。

2.3   蛋白质的理化性质

利用ProtParam tool检索蛋白质序列的理化参数，分析结果表明，BoMYB所翻译成的蛋白质分子质量为29 168.00 Da，分子式为C1263H1997N385O382S15，不稳定系数为59.39，总平均疏水性-0.615，说明该蛋白为亲水蛋白。

2.4   蛋白质二级结构预测

通过PSIPRED在线软件对蛋白质的二级结构进行预测，结果表明，该蛋白有α-螺旋（H）79 个、β-折叠（E）2个，有无规则卷曲（C）182个，即α-螺旋和无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要组成部分。

2.5   蛋白质结构域的预测

利用SMART在线软件预测青花菜MYB基因的蛋白质结构域。该蛋白含有两个SANT结构域，分别位于序列的5-54和 57-105处，符合MYB家族蛋白的结构特征。目前，对MYB家族SANT结构域的研究报道较少。SANT可调控转录活性，在调节目的基因表达的过程中发挥重要的作用[5]。如在拟南芥中，SANT可增加拟南芥对盐和渗透胁迫的抗性，但BoMYB是否能影响青花菜对盐和渗透胁迫的抗性还有待进一步的研究。

3   讨论与展望

转录因子是一类能与启动子结合，并调控下游基因表达的特殊蛋白，常见的有MYB、WRKY、bZIP、AP2和NAC等[6]。MYB以基因家族的形式存在，在植物生长发育、次生代谢、形态建成、生物胁迫和非生物胁迫中起着重要作用[7]。

本研究以青花菜为材料，克隆到了一个MYB基因，命名为BoMYB。BoMYB的基因组DNA全长为903 bp，具有一个内含子，长度为111 bp，以及两个外显子，长度分别为369 bp和423 bp。编码区全长为792 bp，编码263个氨基酸，含两个SANT结构域。

序列比对结果表明，BoMYB与欧洲油菜BnMYB的差异最小，仅存在个别氨基酸残基的差异，与8个拟南芥MYB的差异相对较大，在系统发育树上处于不同的分支。在二级结构中，无规则卷曲和α-螺旋的数量最多，β-折叠的数量最少，仅2个。推测该基因可能在渗透胁迫响应中起作用，以适应缺水等不良环境，但其在这类逆境中的生物学功能尚待进一步研究。下一步将研究BoMYB基因在渗透胁迫下的表达模式，并明确其在该胁迫下的功能。

参考文献：

[ 1 ] Uimari A，Strommer J. Myb26： A MYB-like protein of pea flowers with affinity for promoters of phenylpropanoid genes[J]. The Plant Journal， 1997，12（06）：1 273-1 284.

[ 2 ] Lea U S，Slimestad R，Smedvig P，et al. Nitrogen deficiency enhances expression of specific MYB and bHLH transcription factors and accumulation of end products in the flavonoid pathway[J]. Planta，2007，225（05）：1 245-1 253.

[ 3 ] Hiroshi A，Takeshi U，Takuya I，et al.Arabidopsis At MYC2 （b HLH）and At MYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell，2003，15（01）：63-78.

[ 4 ] 许玲，卫培培，张大勇，等. 大豆转录因子基GmMYB111的克隆及功能分析[J].中国农业科学，2015，48（15）：3 079-3 089.

[ 5 ] 贾乐东，李施蒙，许代香，等.甘蓝型油菜BnMYB80基因的生物信息学分析[J].植物学报，2016，51（05）：620-630.

[ 6 ] Abe H，Urao T，Ito T，et al. Arabidopsis AtMYC2（bHLH） and AtMYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. Plant Cell，2003（15）：63-78.

[ 7 ] 牛义岭，姜秀明，许向阳.植物转录因子MYB 基因家族的研究进展[J]. 分子植物育种，2016，14（08）：2 050-2 059.

（收稿日期：2018-12-17）