恶性血液病EB病毒RPMS1基因多态性分析及意义

赵梦鹤 许玉姣 王海语 刘磊 吴硕 王笑峰

[摘要] 目的 了解青島地区EB病毒（EBV）阳性恶性血液病病人RPMS1基因变异特征，并探讨RPMS1变异与恶性血液病发生发展的关系。

方法选取青岛地区恶性血液病病人345例和健康成人93例为研究对象，采用实时荧光定量PCR测定EBV DNA拷贝数;采用巢式PCR和DNA测序技术，检测EBV阳性恶性血液病病人和健康成人外周血RPMS1序列，根据其特征性突变和系统进化树对基因变异进行分类，并与同一地区健康人群RPMS1变异类型的分布进行比较。

结果有218例EBV阳性标本完成测序分析，共发现3种RPMS1亚型，即RPMS1-A、RPMS1-B和RPMS1-C。RPMS1-A型为主要亚型，在172例标本中检测到，其基因序列高度保守，除个别散在突变外基本与标准株B95-8一致;RPMS1-C相对较少，以D51N突变为特征;RPMS1-B变异型最少，分别以S65N突变和S98G突变为特征。

结论青岛地区EBV阳性恶性血液病和健康人群RPMS1基因型均以RPMS1-A型为主，而RPMS1-B和RPMS1-C变异型的地域性分布及其与恶性血液病的确切关系尚不清楚。

[关键词] RPMS1;疱疹病毒4型，人;白血病;骨髓增生异常综合征;多态性，限制性片段长度

[中图分类号] R733.7

[文献标志码] A

[文章编号]  2096-5532（2019）01-0059-06

SIGNIFICANCE OF EPSTEIN-BARR VIRUS RPMS1 GENE POLYMORPHISM IN PATIENTS WITH HEMATOLOGICAL MALIGNANCY

ZHAO Menghe， XU Yujiao， WANG Haiyu， LIU Lei， WU Shuo， WANG Xiaofeng

（Department of Medical Microbiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the characteristics of RPMS1 gene variation in patients with Epstein-Barr virus （EBV）-positive hematological malignancy in Qingdao， China and the association of RPMS1 variation with the development and progression of hematological malignancy.

MethodsA total of 345 patients with hematological malignancy and 93 healthy adults in Qingdao were selected as subjects. Quantitative real-time PCR was used to measure EBV DNA copy number， and then nested PCR and DNA sequencing were used to determine the sequence of RPMS1 in peripheral blood of the patients with EBV-positive hematological malignancy and healthy adults. The gene variations were classified according to their characteristic mutations and phylogenetic trees， and the distribution of RPMS1 variants was compared between the patients with EBV-positive hematological malignancy and healthy adults.

ResultsSequencing was performed for 218 EBV-positive specimens， and three subtypes of the RPMS1 gene were found， i.e.， RPMS1-A， RPMS1-B， and RPMS1-C. RPMS1-A was a major subtype of RPMS1 and was detected in 172 specimens; its gene sequence was highly conserved and was basically consistent with the standard strain B95-8 except for a few sporadic mutations. RPMS1-C was less common than RPMS1-A and was characterized by D51N mutation. RPMS1-B was the least common subtype and was characterized by S65N mutation and S98G mutation.

ConclusionRPMS1-A is the major subtype of RPMS1 in patients with EBV-positive hematological malignancy and health adults in Qingdao， and further studies are needed to clarify the regional distribution of RPMS1-B and RPMS1-C variants and their association with hematological malignancy.

[KEY WORDS]RPMS1; herpesvirus 4， human; leukemia; myelodysplastic syndromes; polymorphism， restriction fragment length

EB病毒（EBV）是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员，在人群中广泛感染，已有调查显示90%以上的健康成人携带该病毒[1]。EBV感染与人类多种肿瘤的发生发展密切相关，包括Burkitt淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤（NHL）、鼻咽癌、平滑肌肉瘤及胃癌等[2-6]。有关EBV基因多态性的研究已经发现了多种EBV亚型，但EBV变异与肿瘤发生发展的关系仍未明确。鼻咽癌在中国南方地区发病率高，而在中国北方和其他国家较少见。有研究表明，不同地域的EBV呈不同亚型，而同一地区的健康人与肿瘤病人体内EBV呈不同亚型，所以有学者认为EBV基因变异是地域相关而不是疾病相关[7-9]。在EBV潜伏感染期表达的产物除了核抗原（EBNA）家族、潜伏膜蛋白（LMP）以及EBV编码小RNA（EBER）基因之外，还有BamHI A区右向转录产物（BARTs）家族[10-13]。其中，BARTs是EBV潜伏感染时表达最为广泛的基因家族之一，参与多种EBV相关肿瘤的发生发展，而RPMS1基因是迄今为止BARTs家族唯一确定了全长cDNA结构的成员，其编码结构由BARTs基因第Ⅳ、Ⅴ外显子剪接而形成[14-16]。目前尚不清楚RPMS1在恶性血液病中的序列变异情况及其生物学意义。本研究对青岛地区白血病、骨髓增生异常综合征（MDS）及淋巴瘤外周血EBV阳性标本中RPMS1基因多态性进行检测，探讨在恶性血液病发生中EBV感染与RPMS1基因多态性是否存在相互关系，以及RPMS1基因突变在恶性血液病发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2016年12月—2017年12月，选取青岛大学附属医院的住院及门诊病例345例，其中白血病193例，MDS 83例，淋巴瘤69例。以青岛市健康成人咽漱液（TW）93例为对照组。

1.2 试剂与仪器

蛋白酶K、酚、氯仿、异戊醇购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物由北京华大基因生物工程技术服务有限公司合成，高保真Taq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司。PCR扩增仪为美国ABI公司 2700型，DNA测序由北京华大基因生物工程技术服务有限公司完成。

1.3 DNA提取

取受试者外周血4 mL，EDTA抗凝， 1 200 r/min离心10 min，吸取中间白细胞层，采用酚-氯仿-异戊醇抽提法常规提取外周血单个核细胞DNA，无菌水溶解后检测DNA浓度，取100 ng的DNA用于PCR扩增。同时分离血浆置-20 ℃保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR检测EBV DNA拷贝数

采用EBV-PCR荧光定量检测试剂盒实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法检测EBV基因组中特定BamH I-W序列的扩增情况，操作步骤见试剂盒说

明书。引物序列如下。正向：5′-CCCAACACTCCA-CCACACC-3′，反向：5′-TCTTAGGAGCTGTCCG-AGGG-3′;双标记荧光探针：5′-（FAM）-CACAC-ACTACACACACCCACCCGTCTC-（TAMRA）-3′。

用系列濃度梯度（每升1010，109，108，107，106，105拷贝）绘制标准曲线，所有样品均进行重复测定。诊断试剂盒检测下限为每升106拷贝，低于该检测限值的EBV DNA拷贝数被认为EBV阴性。

1.5 PCR扩增

应用巢式PCR技术扩增RPMS1编码基因（B95-8 coordinates138352-160531），所用引物见表1。首先采用RPMS1-1和RPMS1-2进行第1轮扩增，然后应用RPMS1-3和RPMS1-4进行第2轮扩增。第1轮的反应体系为20 μL，包括10×Buffer 2.0 μL，上下游引物各0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA模板100 ng。循环条件如下：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取第1轮PCR产物3 μL为第2轮扩增PCR模板，反应体系为30 μL。循环条件为：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR产物以15 g/L琼脂糖凝胶电泳。每次PCR均设水对照、阴性对照和阳性对照，阳性对照为EBV阳性细胞系B95-8，阴性对照为EBV阴性细胞系Jurkat。

1.6 测序分析

取第2轮PCR扩增产物25 μL，采用末端终止法进行双向测序，测序引物为内侧PCR引物。测序结果应用Chromes软件查看峰图文件，用DNAStar软件（Lasergene，version 7.0）进行剪接序列和对排分析，以EBV标准株B95-8序列（GenBank收录号：V01555）作为参比序列，同时与基因库中相关序列进行对比分析。采用DNAStar软件中Clastal W 方法对基因序列或蛋白序列进行比对和同源性分析，对RPMS1基因变异类型绘制系统树，以辅助对基因变异进行分类。

1.7 统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据间比较采用χ2检验及精确概率法。

2 结  果

2.1RPMS1基因的序列变异

本研究共有218例EBV阳性标本RPMS1基因测序成功，包括76例白血病、34例MDS、24例淋巴瘤及84例健康人TW标本。在所有标本的测序峰图中，同一核苷酸位点均未发现双峰，表明均为单一RPMS1序列。经与B95-8标准株RPMS1基因序列对比，在所有标本中共发现12处核苷酸突变位点，其中9处为错义突变，其余为同义突变。根据RPMS1基因的突变情况，将其分为3种主要类型，并进一步分为4种亚型。所有标本的RPMS1基因变异情况见图1，含有相同核苷酸序列的标本予以合并，并以其中的1例样本作为其代表株。

共检出与B95-8标准株RPMS1核苷酸序列相同的标本172例，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）30例、急性髓细胞白血病（AML）20例、慢性白血病（CL）5例、MDS 32例、NHL 12例、霍奇金淋巴瘤（HL）4例和健康人TW 82例。其中有3例发生同义突变（g155268a、a155282g、g155495a）。另外，在12例标本中各检出散在氨基酸突变，分别为S46Y、P50L、Y54H、P71S、R84H、G91V。以上与B95-8具有相同RPMS1核苷酸序列或只有散在突变位点的分离株归为RPMS1-A型。

有5例标本在第194位密码子发生S65N突变，包括1例AML、1例CL和3例NHL。另外在11例标本中发现S98G突变，包括5例ALL、2例AML、1例CL、2例MDS和1例健康人TW。以上具有S65N突变和S98G突变的分离株分别归为RPMS1-B1和RPMS1-B2亚型，此两种亚型共同组成RPMS1-B型（本文研究均以RPMS1-B型作为一组进行统计分析）。另外，有17例标本中发现D51N突变，包括2例ALL、6例AML、3例CL、5例NHL和1例健康人TW;值得注意的是，在这17例标本中有4例检测到了S65N和D51N两处共有突变，我们将这些具有D51N突变的分离株归为RPMS1-C亚型。

2.2 系统进化树分析

以图1中12条RPMS1基因序列（相同序列只取代表株）绘制系统进化树，系统树共分为3大支系，其中一支为无突变或仅有散在突变的RPMS1-A型;另一支为RPMS1-B型，该支系又分为2组，分别为RPMS1-B1和RPMS1-B2亚型;最后一支为RPMS1-C型。见图2。

2.3RPMS1变异类型在不同疾病中的分布

RPMS1基因各变异型在青岛地区的白血病、MDS、淋巴瘤和健康人TW中的分布见表2。本研究各疾病中RPMS1-A均为主要类型，其在EBV阳性ALL、EBV阳性AML、EBV阳性MDS、EBV阳性淋巴瘤以及EBV阳性健康人TW中所占比率分别为：81.08%（30/37）、68.97%（20/29）、50.00%（5/10）、94.12%（32/34）、60.00%（12/20）和97.62%（82/84）。

标本号下括号中的数字后为与ALL、AML、CL、MDS、NHL、HL和TW样本具有相同核苷酸序列的数目。

使用邻接方法绘制系统进化树，右侧显示RPMS1亚类型。线段的长度对应进化距离。

2.3.1RPMS1基因型在恶性血液病与健康人群的分布比较 EBV阳性ALL、AML、CL、MDS、淋巴瘤以及健康人TW之间RPMS1基因型分布比较结果显示，RPMS1基因型在上述疾病中的分布差异有显著性（χ2=37.296，P<0.01）。进一步分析表明，RPMS1-A型在健康人TW中的比率顯著高于4种EBV相关肿瘤（P<0.01），而健康人TW与MDS中RPMS1基因型分布差异无显著性（P>0.05）;RPMS1-B型在健康人TW的比率显著低于ALL和AML（P<0.05），而在其他疾病中分布差异则无显著性（P>0.05）;RPMS1-C型在健康人TW的比率低于AML和NHL（P<0.01），而在其他疾病中分布差异则无显著性（P>0.05）。

2.3.2RPMS1各亚型在不同恶性血液病之间的分布比较 EBV阳性ALL、AML、CL、MDS以及淋巴瘤之间RPMS1基因各亚型的分布比较结果表明，RPMS1-A及RPMS1-B亚型在不同的恶性血液病之间分布差异无显著性（P>0.05）。RPMS1-C型在EBV阳性的ALL、CL、NHL之间分布差异有统计学意义（P=0.040、0.030）;在EBV阳性的MDS和AML、NHL之间分布差异有统计学意义（P=0.002、0.001）。

3 讨  论

近年来EBV感染与恶性血液病之间的关系已受到国内外学者的广泛关注。有研究显示，骨髓移植后EBV阳性病人易发生淋巴增生性疾病[17]。研究显示，EBV-IgG阳性且EBV-IgM阳性的母亲，其子女罹患ALL的危险性显著增加，表明母亲妊娠期间感染EBV与儿童ALL的发生有关[18]。此外，淋巴细胞白血病是淋巴细胞增殖性疾病，且EBV也可感染淋巴细胞，故考虑淋巴细胞白血病的发病与EBV存在一定关系。至2002年已经报道了1例临床上EBV相关的ALL[19]。因此，EBV感染与恶性血液病的相关性日益受到重视。BARTs家族是EBV重要的致病基因，其编码复杂的基因产物，且其在所有感染细胞类型中稳定表达[20]。重组实验发现其能够在细菌中编码103个氨基酸的蛋白质RPMS1，而杂交实验发现RPMS1可以与RBP-Jk/CBF1相互作用[21]。基于以上研究结果，本文实验对RPMS1基因进行了检测。

本研究成功对青岛地区218例EBV阳性样本中RPMS1基因全长进行了测序及多态性分析，包括76例白血病、34例MDS、24例淋巴瘤以及84例健康人TW标本。本文结果表明，EBV阳性恶性血液病和健康人群中的EBV RPMS1高度保守，均以RPMS1-A型为主要亚型，而以RPMS1-C型为次要亚型，RPMS1-B型最少。

到目前为止，大样本量的关联研究中已经鉴定出以g155391a为代表的与鼻咽癌高风险相关的RPMS1基因序列变异，进一步的研究发现在其他EBV相关肿瘤（如EBVaGC、Burkitt淋巴瘤和HL）与g155391a变异之间并无相关性，表明RPMS1 g155391a变异可能对鼻咽癌的发生发展具有特异性[22-24]。另有研究结果显示，RPMS1在大多数鼻咽癌细胞系及组织中异常表达，但在淋巴瘤细胞系中表达下调甚至不表达，在鼻咽癌外周血淋巴细胞中也未检测到该基因转录，且在鼻咽癌细胞系或鼻咽癌肿瘤活检中并没有内源性RPMS1蛋白表达的报道[25-26]。在RPMS1 g155391a变异中鸟嘌呤突变为腺嘌呤导致了天冬氨酸变为天冬酰胺，而这种氨基酸改变可能与RPMS1转录或表达有关。而本研究中绝大部分RPMS1基因核苷酸序列与标准株B95-8的序列一致，其中有17例标本中检出这一核苷酸突变，这一结果与之前的实验一致[22-24]。

值得注意的是，本文研究结果显示，在EBV阳性白血病中存在RPMS1-C亚型g155391a变异，而EBV阳性MDS中则少有这一变异。MDS是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，向AML转化的概率较高，为白血病的前期病变[27]。推测RPMS1蛋白的第51位氨基酸变异可能与MDS向白血病转化有关，但其机制還需进一步研究。本文结果还显示，RPMS1-B2亚型a155532g变异在健康人TW的比率显著低于急性白血病病人，提示腺嘌呤突变为鸟嘌呤引起的RPMS1蛋白的S98G变异可能与急性白血病的发生发展有关。另外，本研究还发现g155434a与g155391a突变同时出现，该突变此前未见报道，可能为地域性特有突变。因此我们推测，RPMS1蛋白的第84位氨基酸和第91位氨基酸可能存在一定关联。

目前研究关于特定EBV毒株是否可以促进EBV相关恶性肿瘤的发生发展这一问题仍存在争议。根据系统进化树及突变特征，本研究将EBV毒株分为RPMS1-A、RPMS1-B和RPMS1-C等3种基因型。RPMS1-A型是青岛地区的主要亚型，共在172例标本中检出，其基因序列高度保守，除个别散在突变外基本与标准株B95-8一致;RPMS1-C型相对较少，以D51N突变为特征;RPMS1-B变异型最少，分别以S65N突变和S98G突变为特征。对RPMS1基因型分布比较结果显示，EBV阳性恶性血液病和健康人群RPMS1基因的多态性分布差异有显著性，其中RPMS1-B2基因型在健康人群中的比率显著低于急性白血病，提示RPMS1-B2基因型可能与急性白血病发生有关。另外，RPMS1-C基因型在健康人群中的比率显著低于4种EBV阳性恶性血液病，且在白血病中检出率明显高于MDS及健康人TW，提示RPMS1-C基因型可能与MDS向白血病的转化有关。

本研究仅局限于RPMS1基因多态性的分析。为明确RPMS1的3种主要基因型在EBV阳性恶性血液病发生发展中的作用，仍需进行进一步的生物学功能等的研究。

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