镇惊温胆汤药物指纹图谱研究及对PTSD大鼠行为学影响的实验观察

孙天石 高妍 李卫红

摘要 目的：通过SPS模型建立大鼠PTSD模型，研究镇惊温胆汤对SPS模型大鼠的影响。方法：将40只大鼠随机分为正常组、模型组、镇惊温胆汤组和帕罗西汀组，后3组给予SPS造模，之后连续灌胃7 d。结束后检测旷场实验和僵立行为测试。结果：与模型组比较镇惊温胆汤、帕罗西汀组，在大鼠运动总距离，最大运动距离，穿格次数等多个指标上都出现了明显的区别，尤其是在僵立时间方面差异有统计学意义（P<0.01），其中镇惊温胆汤对大鼠产生了显著的作用，使得该组在最长运动距离，直立次数，单次最大运动距离等多个指标（P<0.01），作用优于帕罗西汀组，但在大鼠僵立时间方面与帕罗西汀组比较，差异无统计学意义。结论：本实验成功通过单次延长应激复了创伤后应激障碍大鼠模型，镇惊温胆汤使得SPS模型焦虑和恐惧状态得到改善。

关键词 镇惊温胆汤;创伤后应激障碍;单次延长应激;旷场试验;僵立行为;超高效液相色谱;帕罗西汀;气机

Abstract Objective：To establish a rat model of post-traumatic stress disorder（PTSD）through single-prolonged stress（SPS）and to observe the effect of Zhenjing Wendan Decoction on the behavior of the SPS model rats.Methods：A total of 40 rats were randomly divided into a normal group，a model group，a Zhenjing Wendan Decoction group and a Paroxetine group.The rats in the last 3 groups were modeled by SPS.And then the rags were receiving gavage for 7 days.After that，Open Field Test and Freezing Time Test were performed.Results：Compared with the model group，all groups except the normal group had significant differences in several indicators，such as the total distance of movement，maximum distance of movement and the number of grid penetration，especially in freezing time（P<0.05）.Among them，Zhenjing Wendan Decoction had significant difference，making the indicators of maximum distance of movement，erect times，and single movement distance better than the Paroxetine group，but there was no significant difference in freezing time.Conclusion：This study succeeded repairing PTSD model rats through SPS.Zhenjin Wendan improved the anxiety and fear state of SPS model.

Key Words Zhenjing Wendan Decoction; Post-traumatic stress disorder; Single-prolonged stress; Open Field Test; Freezing Time; Ultra Performance Liquid Chromatography; Paroxetine; Qi movement

中圖分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.015

近年来因为生活条件的改良人门越来越注意到心理疾病对人类的危害，而随着各种自然灾害和日常突发事件的频繁发生，幸存者常会出创伤后应激障碍（Post-traumatic Stress Disorder，PTSD），这也引起了人们对此疾病的关注[1]。镇惊温胆汤是由主治“心胆虚怯，触事易惊”的温胆汤与《四圣心源》治“惊悸之证，土湿胃逆，相火不藏”之金鼎汤二方相合而成。二者立方之意皆为从胆论治。镇惊温胆汤组方为清半夏6 g、生牡蛎9 g、竹茹6 g、生龙骨6 g、陈皮9 g、白芍9 g、枳实6 g、炙甘草3 g、茯苓4.5 g、桂枝9 g、生姜5片（8 g）、大枣1枚（3 g）。在临床使用中镇惊温胆汤对于PTSD等情志疾病取得了一定的疗效，但鲜有其对行为学影响的报道。本试验采用超高效液相色谱（Ultra-high Performance Liquid Chromatography，UPLC）法建立镇惊温胆汤指纹图谱，为该方的稳定性提供科学依据。同时，以西药帕罗西汀为对照，探究镇惊温胆汤对应用单次延长应激造模后对大鼠在行为学方面的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性大鼠40只，平均体质量（170±10）g，为确保实验结果的准确性，本次参加实验的大鼠均选购于维通利华实验动物技术有限公司[SYXK（京）2006-0012]，所有大鼠均饲养于清洁级动物房中，生活环境温度为：22.0～24.0 ℃，40 W日光灯照射，光照节律12L：12D（8：00-20：00），相对湿度：60% ～70%。试验期内饲喂大鼠维持饲料，自由饮水。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

1.1.2 药物 帕罗西汀（浙江尖峰药业有限公司，国药准字H20040533）;镇惊温胆汤中药分为3次购买于北京中医药大学第二附属医院东方医院，浸膏加工则委托北京创立科创医药技术开发有限公司完成。

1.1.3 试剂与仪器 超声仪（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ250DB）;超高效液相色谱系统（美国Waters公司，型号LC-2030，包含超高压溶剂系统和二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站、自动进样恒温样本管理器）;电子天平（上海卓精电子科技有限公司，型号BSM 220.4）;甲酸（色谱纯、德国CNW公司，批号CAS 64-18-6）;大鼠固定装置（北京中医药大学方剂教研室自制）;大鼠运动行为分析系统（荷兰Nodule公司引进，包含先进的数学计算软件，电子设备，监控系统等，型号Ethevision）;水箱（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司，鉴于本实验的需要，选择正方形的水箱，型号ZH-CSC）;旷场箱（自制）;小型水泵（成都新为诚科技有限公司，型号CSP24120）;加热器（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司，型号ZH-CSC）;温度计（常州市希雅仪表有限公司，型号XY003）;娃哈哈纯净水（吉林娃哈哈食品有限公司，生产许可证号SC10621011400578）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 大鼠购买回来后先饲养1周，按照随机数字表法随机分为4组。即正常组、模型组、镇惊温胆汤组和西药对照帕罗西汀组，目前PTSD的造模方法有电击模型（Electric Shocks Model）、捕食场景应激模型（Predator Scent Stress，PSS）、连续单一应激（Single-prolonged Stress，SPS）等[2]，本研究采用国际公认的SPS方法建立PTSD大鼠模型[3]，首先紧密束缚实验鼠2 h，随后强迫其在水中游泳20 min（水深45 cm以上保证老鼠尾部不会接触到箱底），之后将实验鼠捞出，经过15 min休息后，使用乙醚罐将大鼠进行乙醚麻醉，使其进入昏迷状态，造模至此结束。

1.2.2 给药方法 造模完成后，各组大鼠每天早上8：00开始给药，给药方式为灌胃，持续7 d。所有药物使用前以蒸馏水配成所需浓度的混溶液，给药量则需经过精准的计算，一般是按照人的用量的6倍进行换算。镇惊温胆汤组：按照大鼠的实际重量计算给药量，一般来说，灌注37.5 g/kg的震惊温胆汤;帕罗西汀组：按照大鼠的实际体质量计算给药量，一般来说，灌注20 mg/kg的帕罗西汀;正常组、模型组：按照等同上述2组的蒸馏水灌胃处理。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 镇惊温胆汤指纹图谱制备 1）色谱条件的确定：采用Waters Cortecs UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）。常规流速0.4 L/min，柱温为35 ℃。着重选择流动相及测试波长。2）流動相的选择：比较了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.5%甲酸水3种梯度洗脱系统。结果表明乙腈-0.5%甲酸水的梯度洗脱分离效果最好，23 min内出峰完全。见图1。以乙腈（B）-0.5%甲酸水（A）为流动相，洗脱梯度（以B相浓度表示）。见表1。3）检测波长的选择：首先针对镇惊温胆汤浸膏在190～330 nm进行紫外波长测试，着重观察出峰情况，发现在257 nm、283 nm和327 nm时出峰较多，分析后发现在327 nm下出峰较多，各峰比例合适峰形良好，分离度佳，因此选择以327 nm作为检测波长进行后续检测。4）提取溶剂的选择：浸膏的有效成分包含了水溶性成分和脂溶性成分，为了让其均能被有效的提出，查询文献后采用75%甲醇对浸膏进行稀释，并且为了避免产生偏移，提取各单味药材时也同样选用75%甲醇作为提取溶剂。5）稀释倍数的选择：人工选择将浸膏稀释5倍、10倍、20倍和50倍后观察，稀释50倍时浓度最为适宜，各峰出峰良好，波形佳，所以在后续检测中将稀释倍数定为50倍。6）供试药物溶液的配备：在50 mL容量瓶中加入1 mL镇惊温胆汤浸膏后再用甲醇定容，为确保镇惊温胆汤的检测效果，本实验选择浓度为75%的甲醇溶液，经过超声波处理后放在室内静置，待容量瓶中析出沉淀，再用吸管将上层清液吸出，用0.22 μm微孔滤膜过滤，去除初始过滤液，继续过滤液至液相进样瓶中即得。

1.2.3.2 指纹图谱稳定性根据UPLC 图谱分析色谱峰的出峰时间及峰面积是否一致。

1.2.3.3 旷场试验（Open Field Test，OFT）于实验开始前，先对被测试大鼠进行3 d的行为学训练后进行正式实验。正式试验前将大鼠放入实验室中，让大鼠有一个过渡的适应期，15 min后，启动大鼠行为分析系统，对箱内的大鼠进行摄像，工作人员需穿着深色衣服，进入实验室内抓住大鼠的尾部，并将其迅速放入旷场箱。整个过程中不应发出声音及随意运动，以减少声音和光线的影响，进行观察的同时要记下大鼠的运动数据，包括大鼠的直立次数，运动情况等，若大鼠出现长时间静止行为则应额外标注。5 min后取出大鼠，并用乙醇清洁旷场箱擦除大鼠遗留的大小便，防止实验动物在旷场箱内留下自身的特征信息，以避免对之后的试验产生干扰，对大鼠穿格次数进行详细的观察和记录。

1.2.3.4 僵立行为（Freezing Time）实验 开始前，首先把被测大鼠放入行为学室内适应15 min左右，随后调整灯光到水面反光状态消除。随后，工作人员需穿着深色衣服，抓住大鼠的尾部，迅速将其放置到水箱中，使大鼠尽快进入游泳状态，并观察大鼠在5 min内的行为，记录下大鼠进入静止状态的时间，用行为分析系统分析大鼠的行为。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，为了清楚描述数据间的关系，本文采用均值，方差，标准差等多个指标，正态分布的数据采用单因素方差分析的统计方法，非正态分布的数据则使用非参数检验的统计方法进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C