大孔吸附树脂纯化山楂叶黄酮工艺研究

周志强　马娇豪

摘要：对4种大孔吸附树脂纯化山楂叶黄酮效果比较分析，结果显示，D101型大孔吸附树脂对山楂叶黄酮溶液吸附和解吸附效果较好。对山楂叶黄酮纯化工艺进行研究，确定了最优的纯化工艺条件为：采用上柱流速为2BV/h，样液pH值为4.0为上柱吸附条件，洗脱液为70%的乙醇溶液，洗脱液用量为4BV，解析液流速为2BV/h解吸附最优条件。采用D101型大孔吸附树脂纯化后，产品纯度可达94.62%，可用于保健品的分离纯化。

关键词：大孔吸附树脂;山楂叶黄酮;纯化工艺

山楂叶含有丰富的氨基酸、微量元素及丰富的维生素，山楂叶中的黄酮类物质具有一定的清除自由基功能，对心血管系统有一定的药理作用。大孔吸附树脂是近几年发展起来的一类有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，具有价廉、反复利用、吸附容量大等优点，广泛应用于各类黄酮物质的分离纯化，如，山楂黄酮、葛根黄酮、陈皮黄酮、枸杞黄酮、樱桃叶黄酮的分离纯化。

本实验对D101、HPD-200、HPD-500、HPD-600型大孔吸附树脂进行筛选，并对大孔吸附树脂分离纯化山楂叶总黄酮的吸附率和解吸率进行研究，为山楂叶黄酮化合物提取提供适宜的分离纯化条件。

一、材料与方法

（一）材料与试剂

山楂叶：太行山上山楂树落叶前的绿叶;HP-20型大孔吸附树脂购置于日本三菱公司，非极性D-101型大孔吸附树脂购置于天津市海光化工有限公司，HPD-200型大孔吸附树脂、HPD-500型大孔吸附树脂、HPD-600型大孔吸附树脂均由河北沧州宝恩化工有限公司提供。

主要试剂有：蒸馏水（pH7.0～8.0）、NaOH（分析纯）、NaNO（分析纯）、硝酸铝Al（NO），（分析纯）、95%乙醇（分析纯）。

（二）仪器和设备

主要食品设备：

冷冻干燥机（上海翡诺医药设备有限公司）、真空干燥箱（上海皓庄仪器有限公司）、玻璃树脂柱（3cm×50cm）和7200型分光光度计（上海尼龙柯仪器有限公司）、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（北京鑫骉腾达仪器设备有限公司）、BT25S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

（三）大孔吸附树脂的预处理

用蒸馏水洗去破碎树脂粒，湿法装柱，将大孔吸附树脂用适量95%乙醇浸泡24h，然后除去上清液，继续用3BV95%乙醇冲洗至洗出液不浑浊，再用蒸馏水洗至洗出液无醇味;再用3BV的5%稀盐酸以2mL/dmin流速冲洗树脂，浸泡1h后再用蒸馏水以2mL/min流速冲洗至中性;最后用3BV20g/L的氢氧化钠溶液以相同的流速冲洗树脂，浸泡1h后用蒸馏水冲洗树脂层至流出液pH值为中性。

（四）芦丁标准曲线绘制

称取20.8mg芦丁，用60%的乙醇溶解并稀释至100mL，作为对照品溶液。精密量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%NaNO溶液1mL，使混匀放置6min，然后用1mL移液管移取10%的Al（NO）溶液1mL，使混匀放置6min，然后用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，摇匀放置15min，并做空白对照。按分光光度法在500nm波长处测定吸收度，所取标准溶液的浓度和吸收度数据经回归分析，得回归方程为：y=11.687265x-0.008186，R=0.999719，结果表明，芦丁浓度在0.0083～0.04992mg/L范围内具有良好的线性关系。

（五）样品溶液制备

样品溶液取自曹乐民（参考文献7）等人通过传统工艺提取的山楂叶黄酮浸提液。

（六）山楂叶黄酮提取液分离纯化工艺

山楂葉提取液→滤液上柱吸附→解吸→浓缩→干燥→山楂叶黄酮产品。

（七）山楂叶黄酮类物质含量测定

用1mL移液管取静置冷却后的滤液1mL至250mL容量瓶中，再用5mL移液管移取5mL蒸馏水进行稀释，按照标准曲线制作的方法，在500nm波长下，测定溶液吸光度，再由标准曲线方程计算溶液黄酮浓度。

（八）大孔吸附树脂吸附率和解吸率的测定

1、大孔吸附树脂吸附容量和吸附率测定。准确称取处理好的湿树脂2.0g，吸干后装入100mL带塞磨口锥形瓶中，加入山楂叶黄酮水溶液样液50.00mL（V0），浓度为1.438mg/mL（C），置于摇床上（温度25℃，转速150r/min）振荡吸附24h后过滤，测定滤液中黄酮类物质的浓度，计算大孔吸附树脂的静态吸附容量和吸附率，计算公式如下：

3、大孔吸附树脂的吸附动力学特征。称取预处理过的大孔吸附树脂2.0g（湿重）于带塞锥形瓶中，精密量取50.00mL黄酮溶液，置于摇床上（温度25℃，转速150r/min）振荡吸附，在12h内，每次取1.00mL。以大孔吸附树脂与样液接触时开始计时，然后按下列时间10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h，以大孔吸附树脂的黄酮静态吸附量（E）对时间（t）作图，绘制大孔吸附树脂的吸附动力学曲线。

二、结果与讨论

（一）大孔吸附树脂的筛选

1、不同大孔吸附树脂对山楂叶黄酮溶液的吸附效果。称取4种经过预处理的大孔吸附树脂各2.0g于100mL磨口带塞锥形瓶中，分别加入50.00mL山楂叶黄酮水溶液，于摇床上（温度25℃，转速150r/min）振荡吸附24h后抽滤，测定滤液中黄酮溶液的吸光度，计算静态吸附容量和吸附率，结果见表1。从表1中可以看出，D101型和HPD-200型大孔吸附树脂的静态吸附容量和吸附率明显较高。因此，可以初步确定选用D101型和HPD-200型大孔吸附树脂作为实验用树脂。

2、不同大孔吸附树脂对山楂叶总黄酮的解吸附效果。用蒸馏水洗涤树脂至无色不浑浊，加入体积分数为70%的乙醇溶液解吸附，置于摇床上以同样的方法处理后取出，真空抽滤，测定溶液的吸光度，计算解吸附率，结果见表2。从表2的解吸附实验发现，D101型大孔吸附树脂较HPD-200型大孔吸附树脂的解吸附率高，因此，选用D101型大孔吸附树脂进行吸附和解吸附最合适。

3、大孔吸附树脂动力学吸附曲线。4种大孔吸附树脂的动力学吸附曲线如图1所示。

从图1中可以看出，4种大孔吸附树脂对样液的吸附均属于快速平衡型，3h即达到平衡。不同类型大孔吸附树脂对样液中山楂叶总黄酮的吸附速率差异明显，在4种大孔吸附树脂中，D101型大孔吸附树脂吸附容量最大，吸附速率最快。

（二）吸附条件对大孔吸附树脂吸附效果的影响

1、上柱流速对树脂吸附效果的影响。取浓度为1.0mg/mL、pH为4.0的山楂叶黄酮水溶液，分别于1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速上柱吸附，结果见表3。

从表3中可以看出，上柱流速越小，大孔吸附树脂的吸附量和吸附率越大。但上柱速率越小，耗费时间就越长，生产成本越高。综合考虑，上柱流速为2BV/h较合适。

2、样液浓度对树脂吸附效果的影响。流速为2BV/h、pH为4.0时，分别以不同浓度的样液浓度上柱吸附，考察样液浓度对吸附效果的影响，结果见表4。

从表4中可以看出，随着样液浓度的增加，树脂的吸附容量和吸附率不是呈线性增加，当样液浓度超过2.0mg/mL时，吸附量和吸附率均下降，说明此时已經超过D101大孔吸附树脂的最大动态吸附容量，吸附柱开始出现泄漏，因此，样液浓度为2.0m/mL最合适。

3、样液pH值对树脂吸附效果的影响。样液浓度为2.0mg/mL、上柱流速为2BV/h时，分别以不同pH值的样液上柱吸附，考察吸附效果，结果见表5。

从表5可以看出，在酸性条件下，D101大孔吸附树脂对样液中黄酮类物质的吸附容量和吸附率没有明显差别，但随着pH值的增大，树脂的吸附容量和吸附率先增加，增加到一定时间后又降低，以pH值为4.0时，树脂的吸附量和吸附率最高，因此，吸附液pH以4.0为最佳。

（三）解吸附条件对解吸效果的影响

1、解吸液体积分数对解吸效果的影响。对静态吸附饱和的D101大孔吸附树脂，采用不同浓度的乙醇溶液对大孔吸附树脂解吸附，考察不同体积分数的乙醇溶液对解吸附效果的影响，结果如图2所示。

从图2可以看出，随着解吸液乙醇体积分数的增加，山楂叶黄酮的解吸率不断增加，当乙醇体积分数为70%时，大孔吸附树脂的解吸率趋于稳定，考虑到环境污染、价格成本等因素，选用70%的乙醇溶液作为D101大孔吸附树脂的解吸液最为合理。

2、解吸液用量对解吸效果的影响。称取预处理好的D101大孔吸附树脂，加入适量的样液，振摇使树脂吸附至饱和，用蒸馏水洗至无色;湿法装柱，然后用70%的乙醇溶液洗脱，流速控制在3BV/h，收集洗脱液，每0.5BV（10min）收集一个馏分，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算解吸附率，绘制洗脱曲线，结果见图3。

从图3中可以看出，当洗脱液用量为1.8BV时，山楂叶黄酮开始被洗脱下来;洗脱液用量为4BV时，解吸附率约98.7%，树脂上吸附的绝大部分的黄酮类物质被洗脱下来。因此，综合考虑效率、成本等因素，洗脱液的用量为4BV最佳，即洗脱液用量为柱床体积的3倍时解吸效果是好。

3、解吸附流速对解吸附效果的影响。称取预处理好的D101大孔吸附树脂，加入样液吸附至饱和，用无色蒸馏水洗至无色，湿法装柱，用4BV的70%乙醇溶液，分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速对吸附饱和的树脂洗脱，收集洗脱液，测定解吸附率，结果见表6。

从表6中可以看出，解吸附流速为1BV/h与2BV/h时，二者解吸附率相近，随着流速的增加，解吸附率减小，表明流速为2BV/h时，解吸速率高、效果更好。综合考虑，选择2BV/h流速作为D101大孔吸附树脂树脂的解吸附流速。

（四）大孔吸附树脂再生性能的确定

以山楂叶黄酮溶液为样液、上柱流速为2BV/h、样液pH值为4.0、洗脱液为70%的乙醇溶液、洗脱液用量为4BV、解析液流速为2BV/h为条件，重复进行实验，测定D101大孔吸附树脂的吸附率和解吸附率。结果发现，D101大孔吸附树脂重复进行6次实验，吸附率和解析率均在94%以上，说明D101大孔吸附树脂用于山楂叶黄酮溶液的分离纯化有较好的重复使用性能。

（五）山楂叶黄酮纯化效果的测定

经过D101大孔吸附树脂处理后，对山楂叶黄酮处理液进行浓缩干燥，样液中总黄酮得到有效富集纯化，总黄酮纯度最高可达94.62%。

三、结论

经过对D101、HPD-200、HPD-500、HPD-600四种大孔吸附树脂对山楂叶黄酮纯化效果比较，结果表明D101大孔吸附树脂最适合于山楂叶黄酮的纯化。

对山楂叶黄酮纯化条件筛选试验结果表明，采用上柱流速为2BV/h、样液pH值为4.0为上柱吸附条件;洗脱液为70%的乙醇溶液，洗脱液用量为4BV，解析液流速为2BV/h为解吸附条件时吸附效率和解吸附效率均较高。

经过6次重复对山楂叶黄酮溶液纯化后的D101大孔吸附树脂所得的黄酮纯化物纯度仍能保持在94.62%，能用于各种保健品的开发利用，表明D101型大孔吸附树脂具备较好的重复使用性能。

（责任编辑 曹雯梅）