丹黄通脉方对颈动脉粥样硬化性狭窄模型大鼠炎性反应及脑血流量的影响

李嘉民 刘海涛 马建刚 杨春燕

摘要 目的：探究丹黃通脉方对颈动脉粥样硬化性狭窄模型大鼠炎性反应及脑血流量的影响。方法：将SPF级、雄性SD大鼠80只随机分为正常组、阳性对照组、模型组和观察组，每组20只。阳性对照组、模型组及观察组大鼠均采用高脂加高蛋氨酸复合饲料喂养联合颈总动脉球囊拉伤术法构建颈动脉粥样硬化性狭窄大鼠模型，正常组给予普通饲料喂养，且不进行颈总动脉球囊拉伤术。造模成功后，阳性对照组大鼠给予辛伐他汀2.5 mg/kg灌胃给药，观察组大鼠给予丹黄通脉方20 g/kg（浓度：10 mL/kg）灌胃给药，正常组与模型组则灌胃等量生理盐水，2次/d，各组均连续给药8周。干预结束后，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中血脂四项总胆固醇（TC），三酰甘油（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平;采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）及同型半胱氨酸（Hcy）水平;HE染色观察大鼠颈动脉病理学形态变化;采用激光多普勒血流仪测定各组大鼠脑血流量。结果：与正常组比较，模型组和观察组TC、TG、LDL-C水平，TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平显著升高，而HDL-C显著降低;但与模型组比较，阳性对照组和观察组TC、TG、LDL-C水平，炎性反应递质TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平显著降低，而HDL-C显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与正常组比较，模型组和观察组大鼠局部脑血流量显著降低;与模型组比较，阳性对照组和观察组大鼠脑血流量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：丹黄通脉方可有效降低颈动脉粥样硬化性狭窄大鼠的血脂，具有抗炎作用，可降低炎性递质水平，可增加脑血流量。

关键词 丹黄通脉方;颈动脉粥样硬化性狭窄;炎性反应;脑血流量

Effects of Danhuang Tongmai Recipe on Inflammatory Reaction and Cerebral Blood Flow in Rats with Carotid Atherosclerotic Stenosis

LI Jiamin， Liu Haitao， Ma Jiangang， Yang Chunyan

Abstract Objective：To investigate the effects of Danhuang Tongmai Recipe on inflammatory response and cerebral blood flow in rats with carotid atherosclerotic stenosis. Methods：A total of 80 SPF and male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a normal group （n=20）， a positive control group （n=20）， a model group （n=20） and an experimental group （n=20）. Rats in the positive control group， the model group and the experimental group were treated with high-fat plus methionine compound feed combined with carotid artery balloon injury to construct a rat model of carotid atherosclerotic stenosis. The normal group was fed with normal feed and no ballooning of the common carotid artery was performed. After successful modeling， rats in the positive control group were given simvastatin 2.5 mg/kg by intragastric administration， and rats in the experimental group were administered with Danhuang Tongmai Recipe 20 g/kg （concentration：10 mL/kg）. The normal group and the model group were given the same amount of normal saline twice a day， and each group was continuously administered 8 weeks. After the intervention， the levels of TC， TG， LDL-C and HDL-C in the serum of the rats in each group were detected by automatic biochemical analyzer; The levels of TNF-α， IL-6， CRP and Hcy in the serum of each group were detected by ELISA; HE staining was used to observe the pathological changes of carotid artery in rats; The cerebral blood flow of each group was measured by laser Doppler flowmetry. Results：Compared with the normal group， the levels of TC， TG， LDL-C， TNF-α， IL-6， CRP and Hcy in the model group and experimental group significantly increased， while HDL-C significantly reduced; Compared with the model group， TC， TG， LDL-C levels， inflammatory factors TNF-α， IL-6， CRP and Hcy levels significantly reduced in the positive control group and the experimental group， while HDL-C significantly increased （P<0.05）; At the same time， compared with the normal group， the cerebral blood flow significantly reduced in the model group and the experimental group; Compared with the model group， the cerebral blood flow of the positive control group and the experimental group significantly increased （P<0.05）. Conclusion：Danhuang Tongmai Recipe can effectively reduce the blood lipids of rats with carotid atherosclerotic stenosis， with anti-inflammatory effects， which can reduce the level of inflammatory mediators. At the same time， it can also increase cerebral blood flow， which is worthy of clinical recommendation.0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

Key Words Danhuang Tongmai prescription; Carotid atherosclerotic stenosis; Inflammatory reaction; Cerebral blood flow

中圖分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.020

近年来，颈动脉粥样硬化性狭窄的发病率逐年升高，是缺血性血管疾病的重要致病因素。已有研究证实，颈动脉粥样硬化是一种炎性反应性疾病，血脂异常是动脉粥样硬化的独立危险因素，血脂代谢紊乱可激活炎性反应，促进疾病的发生、发展[1-2]。研究发现，颈动脉粥样硬化性狭窄可引起不同程度的脑血流动力学障碍，是脑中风的独立危险因素[3]。丹黄通脉方由丹参、黄连、葛根和三七组成，具有调节血脂、稳斑通脉、抗炎等功效。为此，本研究旨在探究丹黄通脉方对颈动脉粥样硬化性狭窄模型大鼠炎性反应及脑血流量的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级、雄性、健康SD大鼠80只，6～8周龄，体质量250～300 g，购于第四军医大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（军）2007-007号。

1.1.2 药物

丹参、黄连、葛根和三七粉饮片（陕西中医学院第二附属医院）;高脂加高蛋氨酸饲料（北京科澳协力饲料有限公司）;辛伐他汀（成都华宇制药有限公司，批号：090702）。丹黄通脉方由丹参、黄连、葛根和三七粉组成（质量比为2∶1∶1∶0.2），取适量水煎煮2次，浓缩至浓度为2 g/mL，密封。

1.1.3 试剂与仪器

总胆固醇（TC），三酰甘油（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（德国罗氏诊断有限公司）;肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）及同型半胱氨酸（Hcy）酶联免疫吸附试验检测试剂盒（北京普尔伟业生物科技有限公司）等。

LEICARM2235石蜡切片机（德国Leica公司）;5417R型台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）;PF5001激光多普勒血流仪（瑞典PERIMED公司）;BH2生物显微镜（苏州鸥斯特光学仪器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将SPF级、雄性SD大鼠80只随机分为正常组、阳性对照组、模型组及观察组。正常组大鼠给予普通饲料喂养，其余各组大鼠给予高脂加高蛋氨酸复合饲料喂养，4周末采血检测血清TC和Hcy值，确定升高后行颈总动脉球囊拉伤术：4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，结扎右颈外动脉远心端，阻断右颈总动脉近心端及右颈内动脉血流，于右颈外动脉远心端放入2.0F动脉去栓导管，充入0.1～0.2 mL气体，然后匀速回拉球囊，并回抽球囊内气体，取出导管，恢复血流[4]。将建模成功的60只颈动脉粥样硬化性狭窄大鼠随机分为阳性对照组、模型组及观察组，每组20只。

1.2.2 给药方法

阳性对照组大鼠给予辛伐他汀2.5 mg/kg灌胃给药，观察组大鼠给予丹黄通脉方20 g/kg（浓度为：10 mL/kg）灌胃给药，正常组与模型组则灌胃等量生理盐水，2次/d，各组均连续给药8周。

1.2.3 检测指标与方法

全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中血脂水平：末次药物干预后，各组大鼠断尾取血，血液标本离心，3 000 r/min，15 min，取上清液。采用全自动生化分析仪检测大鼠血脂水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP及Hcy的水平：将采集好的各组大鼠的血液标本离心，3 000 r/min，15 min，取上清液。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中TNF-α、IL-6、CRP及Hcy的水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

苏木精-伊红（HE）染色观察颈动脉病理学形态：末次药物干预后，处死各组大鼠，收集颈动脉标本。4%多聚甲醛固定，经脱水、包埋、切片等步骤后进行HE染色，于光镜下观察颈动脉内膜增生、炎性细胞浸润、管壁增厚及管腔狭窄等病理变化。

脑血流量测定：末次药物干预后，采用4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定大鼠头部，在额顶约1 cm处暴露颅骨，牙科钻在左侧颅骨钻开一个颅窗（约4 mm×4 mm），剥离使露出软脑膜。采用激光多普勒血流仪监测脑血流值，以灌注单位（PU）表示，记录3次，取平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂TC，TG，LDL-C及HDL-C水平比较

与正常组比较，模型组、观察组大鼠血脂TC、TG、LDL-C水平显著升高，而HDL-C显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;但与模型组比较，阳性对照组和观察组TC、TG、LDL-C水平显著降低，而HDL-C显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平比较

与正常组比较，阳性对照组、模型组和观察组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;但与模型组比较，阳性对照组和观察组炎性反应因子TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

2.3 各组大鼠颈动脉病理学改变情况比较

正常组大鼠颈动脉内膜光滑，未观察到内膜增生，内皮细胞完整，平滑肌细胞形态规则，且未见脂质沉积。模型组颈动脉内膜增厚，结构不清晰，有大量炎性细胞浸润，伴胆固醇结晶及钙化病灶。阳性对照组和观察组大鼠颈动脉内膜轻度增厚，内膜欠光滑，伴少量纤维增生及炎性细胞浸润。见图1。

2.4 各组大鼠脑血流量比较

正常组、模型组、阳性对照组及观察组大鼠脑血流量值分别为（392.31±79.25）PU、（218.57±75.24）PU、（364.82±71.36）PU和（321.93±68.83）PU。与正常组比较，模型组和观察组大鼠局部脑血流量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，阳性对照组和观察组大鼠脑血流量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

动脉粥样硬化通常表现为脂质沉积，伴平滑肌细胞增殖，引起管壁增厚、管腔狭窄，进而导致内皮功能障碍和血管炎性反应[5]。同时，动脉粥样硬化往往发生在颈动脉分叉处，造成颈动脉斑块和狭窄。研究发现，颈动脉粥样硬化性狭窄与缺血性脑血管病密切相关[6]。近年来，中医药治疗颈动脉粥样硬化性狭窄疾病备受关注，也取得了较大进展。

中医学理论认为，颈动脉粥样硬化性狭窄属于热毒血瘀证，该病位在血脉，瘀血停聚，气血运行受阻，日久成“毒”，损伤脉络，进而阻痹脉管。丹黄通脉方由丹参、黄连、葛根、三七组成，丹参活血化瘀，黄连清热解毒，两药配伍祛瘀血，解瘀毒，佐以葛根通利血脉，三七活血消斑，全方具有活血解毒、消斑通脉的功效。血脂代谢紊乱可造成血管内皮功能受损，促进炎性反应递质释放，进而加速颈动脉粥样硬化狭窄的发展[7]。研究发现，急性脑血管病患者血清中TNF-α与IL-6水平显著增加[8]。也有研究发现，颈动脉粥样硬化患者血清TNF-α与IL-6水平明显升高，且随着疾病加重而呈上升趋势，提示TNF-α与IL-6参与颈动脉粥样硬化的形成与发展[9]。CRP是一个独立的动脉硬化预测指标。研究表明，CRP可能直接参与了颈动脉粥样硬化的形成，且与颈动脉粥样硬化有明显相关性[10]。

Hcy可能是动脉粥样硬化等心血管疾病的一个独立危险因子引起关注，研究发现，Hcy能加剧局部炎性反应，进而促进颈动脉粥样硬化发展，并与脑卒中密切相关[11]。已有研究证实，颈动脉粥样硬化患者血清中Hcy表达显著增加，且Hcy表达水平与颈动脉粥样硬化程度正相关[12]，并推测Hcy与颈动脉粥样硬化性狭窄和斑块的形成密切相关。研究发现，黄连和三七可有效降低血管炎性反应和氧化应激反应，也可通过抗炎和调节血脂等作用，抑制动脉粥样硬化发展[13]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组和观察组TC、TG、LDL-C水平，TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平显著升高，而HDL-C显著降低;但与模型组比较，阳性对照组和观察组TC、TG、LDL-C水平，炎性反应递质TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平显著降低，而HDL-C显著升高，提示丹黄通脉方可有效降低颈动脉粥样硬化性狭窄大鼠的血脂，也可降低炎性反应递质水平，具有抗炎作用。

脑血流量的测定是评价脑缺血损伤与修复的重要指标，同时，颈动脉粥样硬化性狭窄可引起不同程度的脑血流障碍。研究发现，丹参具有增加微循环灌流量，改善脑部微循环、减轻颈动脉粥样硬化狭窄的作用;黄连提取物也可扩张软脑膜微循环，改善微循环障碍，维持大脑血流量;葛根可使脑内耗氧降低，对脑缺血、缺氧具有保护作用[14];研究发现，三七总皂苷可明显扩张小鼠软脑膜微血管，增加局部血流量，保护脑组织[15]。有研究表明，丹黄通脉方可增加颈动脉粥样硬化模型大鼠的脑血流量，具有预防因脑缺血、缺氧导致脑组织损伤的作用[16]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组和观察组大鼠局部脑血流量显著降低;与模型组比较，阳性对照组和观察组大鼠脑血流量明显升高，提示丹黄通脉方可增加脑血流量，降低脑血流障碍，保护大鼠脑组织。

综上所述，丹黄通脉方可有效降低颈动脉粥样硬化性狭窄大鼠的血脂，具有抗炎作用，可降低炎性反应递质水平，同時，还可增加脑血流量。

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（2019-09-27收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：河北省卫生健康委医学科学研究课题计划项目（ZD20140457）作者简介：李嘉民（1972.05—），男，硕士，主任医师，研究方向：脑血管病，E-mail：ssrmn2@163.com0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F