基于生理生化指标选择红锥二代优良家系

谭长强 申文辉 刘秀 曹艳云 黄志玲 郝海坤

摘 要：通過对29个红锥优树二代家系苗光合碳氮同化过程关键物（叶绿素、硝酸还原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性、总ATP酶含量、PEP羧化酶含量和RUBP羧化酶含量）进行测定，运用主成分分析及隶属函数法进行优良家系的筛选和评价。结果表明：9个生理指标29个家系间均存在显著差异。叶绿素a含量为0.13～0.72 mg·g-1FW，叶绿素b含量为0.01～0.27 mg·g-1FW，叶绿素a+b含量为0.18～0.98 mg·g-1FW，类胡萝卜素含量为0.03～0.32 mg·g-1FW，硝酸还原酶活性为1.16～10.26 μg·g-1·h-1，谷氨酰胺合成酶活性为0.30～1.24 A·mg-1protein·h-1，总ATP酶含量为0.37～3.55 U·mg-1 prot，PEP羧化酶含量为8.42～21.24 IU·L-1，RUBP羧化酶含量为2.09～9.12 ng·mL-1。其中，总ATP酶含量变异最大，其次为硝酸还原酶活性，变异最小的为RUBP羧化酶含量。采用主成分分析及隶属函数法分别筛选出10个红锥优树二代优良家系，重复率达到90%，分别为B2、B5、P5、A6、P3、P6、R3、D2、R4家系。这说明主成分分析法和隶属函数法均可用于评价红锥二代优良家系。

关键词： 转化酶， 隶属函数法， 苗期变异， 主成分分析法， 苗期选择

Seedling selection of the second superior families of Castanopsis hystrix based on the analysis of physiological indices

TAN Zhangqiang， SHEN Wenhui*， LIU Xiu， CAO Yanyun， HUANG Zhiling， HAO Haikun

（ Guangxi Academy of Forestry， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530002， China ）

Abstract：By using 29 families of Castanopsis hystrix seedlings as experimental material， we measured key substances in the process of photosynthetic carbon and nitrogen assimilation of Chlorophyll， nitrate reductase and glutamine synthetase activity， total contents of ATP enzyme， PEP carboxylase and RUBP carboxylase content， and their superiorities were evaluated with principal component analysis and membership function method. The results were as follows： There were significant differences of all indexes among the 29 families. Chlorophyll a content varied from 0.13 to 0.72 mg·g-1FW， chlorophyll b content varied from 0.01 to 0.27 mg·g-1FW， chlorophyll （a+b） content varied from 0.18 to 0.98 mg·g-1FW， carotenoid content varied from 0.03 to 0.32 mg·g-1FW，nitrate reductase （NR） activity varied from 1.16 to 10.26 μg·g-1·h-1， glutamine synthetase （GS） activity varied from 0.30 to 1.24 A·mg-1protein·h-1， total contents of ATPase varied from 0.37 to 3.55 U·mg-1 prot， PEP Case content varied from 8.42 to 21.24 IU·L-1 and RUBP case content varied from 2.09 to 9.12 ng·mL-1. Among indexes， the total contents of ATP enzyme varied most， followed by the nitrate reductase activity， and the RUBP carboxylase content varied minimum. The ten families was selected respectively by principal component analysis and the method of subordinate function respectively and repetition rate reached 90%. Repeat the families were B2， B5， P5， A6， P3， P6， R3， D2 and R4 families. This instructed that principal component analysis and subordinate function method are good for the evaluation of the second generation family of Castanopsis hystrix.

Key words： invertase， membership function method， seedling stage variation， principal component analysis， seedling selection

早期选择是林木未达到经济成熟前所进行的选择（杨秀艳等，2004）。前人研究指出，对林木苗期个体及优良家系的选择，不仅能缩短育种周期，而且还能降低测定林的试验规模，更好地提高林木遗传增益，降低试验成本（杜克兵等，2009;刘代亿等，2009;王军辉等，2000）。叶绿素具有吸收和传递光能的作用，为植物光合作用提供最原始的能量来源，其含量的高低在一定层度上可以反映植物生产能力（高红霞等，2016;陈隆升，2009）。硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、总ATP酶、PEP羧化酶和RUBP羧化酶等转化酶是衡量植物同化及转化利用能力，以及植物细胞代谢及生长强度的指标（高红霞等，2016;陈隆升，2009;蔡瑞国等，2008;杨亮等，2007;郝乃斌等，1991;潘瑞炽，2010;吴正锋等，2014;赵蓉等，2013; Liu et al.， 2015;周竹青等，2009;陈颖等，2015）。因此，通过研究红锥苗期生理及转化酶指标，进行红锥优良家系的苗期筛选具有现实的可行性。

红锥（Castanopsis hystrix）为壳斗科锥属（Castanopsis）的常绿乔木，是优质珍贵用材树种，适应性强，生长快（朱积余等，2014）。目前，仅广西红锥造林面积在15 000 hm2以上，随着国家乡土珍贵树种木材储备计划的实施、市场对高档珍贵用材需求的增长及天然林的禁伐，红锥人工造林的区域将进一步扩大。而对红锥的遗传改良研究相对滞后，难以满足生产对其的需要。当前对红锥遗传改良研究多集中在红锥优树一代家系生长性状、光合能力等方面（朱积余等，2014;蒋燚等，2013），有关利用红锥光合碳氮同化过程中关键物质的红锥二代优良家系早期选择尚未见有报道，本研究将为红锥进一步的选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验设置在广西南宁广西林科院珍贵树种苗圃（108°20′ E，22°55′ N），属湿润的亚热带季风气候，海拔约80 m，7—8月平均气温28.2 ℃，1月平均气温12.80 ℃，极端最高气温39.4 ℃，极端最低气温-1.5 ℃，年均气温21.7 ℃。日照时数在1 550 h以上，10 ℃积温为7 200 ℃，全年几乎无霜;年均降雨量1 300 mm，干湿季节明显，主要集中在4—9月。土壤为赤红壤，pH值为5.6，肥力中等，土壤经风干、粉碎、过筛备用。

1.2 材料及来源

种子于2016年11—12月采集于广西凭祥的红锥优树子代林，共计29个家系。沤晒去壳后，先筛选健壮饱满种子，然后将所有种子撒于沙床中催芽，待60%～70%的种子胚芽出土时即可开始移植，选取长出胚芽或叶子的小苗进行移植至规格为18 cm × 18 cm的育苗袋中，基质为黄心土。育苗采取相同的水肥、杀虫等管理措施。

1.3 生理指标测定

2018年1月，选择每个家系苗高、地径平均值附近的5株进行生理指标的测定，每株选取3片无病虫害、刚成熟而未老化的叶片，每个指标3次重复。各指标测定方法如下，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量采用丙酮-乙醇混合提取法（邹琦，2000），硝酸还原酶活性采用活体法（邹琦，2000），谷氨酰胺合成酶参照蔡红梅等（2010）的测定方法，总ATP酶采用南京建成的超微量ATP酶测试盒测定，PEP羧化酶、RUBP羧化酶采用酶联免疫法的ELISA试剂盒测定。

1.4 数据分析与统计

利用WPS、DPS7.05和SPSS19.0对试验数据进行整理及统计分析。不同红锥家系综合评价用隶属函数法，其公式为u（xij）=（xij-xjmin）/（xjmax-xjmin）（1）

式中，u（xij）为红锥i家系j指标的标准化值，xij为红锥i家系j指标值，xjmax为各家系j指标的最大值。确定不同指标的权重，权重确定采用标准差系数法。计算标准差系数vj，再求各指标的权重wj。

vj=（∑ni=1（xij-xj）2）/xj（2）

wj=vj/∑nj=1vj（3）

求不同家系各指标的综合评价值，来衡量不同红锥优树二代苗木的优劣状况。

D=∑nj=1[u（xj）×wj]（4）

2 结果与分析

2.1 29个红锥优树二代家系苗生理指标

从表1可以看出，29个家系的叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素、硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、总ATP酶、PEP羧化酶、RUBP羧化酶在29个红锥二代家系间差异显著（P<0.05）。这表明红锥优树二代家系间存在丰富变异，开展红锥优树二代优良家系的苗期选择是可行的。其中，叶绿素a含量为0.13～0.72 mg·g-1FW，平均值为0.38 mg·g-1FW，P5家系含量最高，比平均值高155.8%;叶绿素b含量为0.01～0.27 mg·g-1FW，平均值为0.12 mg·g-1FW，P5家系含量最高，比平均值高209.3%;叶绿素a+b含量为0.18～0.98 mg·g-1FW，平均值为0.50 mg·g-1FW，P5家系含量最高，比平均值高160.2%;类胡萝卜素含量为0.03～0.32 mg·g-1FW，平均值为0.13 mg·g-1FW，R2家系含量最高，比平均值高222.1%;硝酸還原酶活性为1.16～10.26 μg·g-1·h-1，平均值为5.00 μg·g-1·h-1，B5家系含量最高，比平均值高182.1%;谷氨酰胺合成酶活性为0.30～1.24 A·mg-1protein·h-1，平均值为0.54 A·mg-1protein·h-1，P4家系含量最高，比平均值高172.8%;总ATP酶含量为0.37～3.55 U·mg-1 prot，平均值为1.36 U·mg-1 prot，A9家系含量最高，比平均值高233.8%;PEP羧化酶含量为8.42～21.24 IU·L-1，平均值为13.57 IU·L-1，B5家系含量最高，比平均值高94.5%;RUBP羧化酶含量为2.09～9.12 ng·mL-1，平均值为6.92 ng·mL-1，B2家系含量最高，比平均值高101.5%。

2.2 单个指标选择的潜力

通过对单个指标的选择（表2）可以了解红锥优树二代家系内各指标遗传改良的最大潜力，每个指标下排名前10的优良家系相互交叉但不完全相同。排名前10的家系平均值高出总体平均值，最大的指标为总ATP酶含量;其次为硝酸还原酶活性;最小的为RUBP羧化酶含量。

2.3红锥二代优良家系的苗期选择

2.3.1 主成分分析法 从表3可以看出，根据累计贡献率>80%的原则选取前4个主成分进行分析，它们的累计贡献率为80.6%，表明前4个主成分能代表所有抗旱指标进行不同家系间抗旱性评价。第一主成分主要有叶绿素a、叶绿素b、叶绿素（a+b）、类胡萝卜素，其特征值为3.56，贡献率为39.6%;第二主成分主要有硝酸还原酶、总ATP酶、PEP羧化酶，其特征值为1.47，贡献率为16.3%;第三主成分主要有谷氨酰胺合成酶、PEP羧化酶， 其特征值为1.20， 贡献率为13.3%; 第四主成分主要有谷氨酰胺合成酶、总ATP酶、RUBP羧化酶，其特征值为1.03，贡献率为11.4%。运用主成分分析法对29个红锥优树二代家系进行优选排序，排序前10的家系（表4）分别为B2>B5>P5>A6>P3>P6>R3>D2>P7>R4。

2.3.2 隶属函数法 运用隶属函数法排序后， 排在前10的家系（表5）分别为B2>B5>A6>D2>A9>P3>P5>R4>P6>R3。

2.3.3 优良家系综合选择 利用主成分分析法和隶属函数法两种评价方法得到的结果不完全相同，但总体趋势一致（表4，表5）。以两种方法中共有的家系为入选家系，选出B2、B5、P5、A6、P3、P6、R3、D2、R4。

3 讨论与结论

植物生理代谢过程是环境及基因调控共同作用的结果。在控制环境下，如果某一植物在某种性状上基因型存在差异，那么该种差异将会体现在与之对应的生理生物标记上 （蔡红梅等，2010;姜磊等，2005）。本研究中，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素、硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、总ATP酶、PEP羧化酶、RUBP羧化酶在29个红锥优树二代家系间具有显著性差异，反映出红锥优树二代家系间存在丰富的遗传多样性，这为开展红锥优树二代家系的苗期选择提供了物质基础。同样，赵蓉等（2013）对栓皮栎优树子代硝酸还原酶等生理生化特性进行了研究，也认为栓皮栎子代家系之间存在显著差异，可以初步作为栓皮栎速生性状早期选择的指标。

从单个指标进行选择红锥优树二代家系，各指标入选的家系存在一定的重复和差异。一方面说明各光合碳氮同化生理指标之间存在一定相关性，各指标所反映的信息存在重叠性;另一方面说明单个指标在红锥生长过程中作用不同，对红锥优良家系进行筛选准确性存在偏差。因此，通过多指标的方法进行评价和筛选才能更好地达到预期的目的。目前，多指标的综合筛选与评价主要有隶属函数法、主成分分析法和聚类分析法（杨升等，2013）。姜顺邦等（2016）运用隶属函数法对闽楠优树子代苗期进行了优选。高红霞等（2016）同时采用隶属函数法和主成分分析法对红砂家系进行评价，最终两种方法筛选出的优良家系重合率达到80%。本研究得出了类似的结果，两种方法综合评价筛选出的排名前10的家系，重复率达到90%，分别为B2、B5、P5、A6、P3、P6、R3、D2、R4家系。这表明主成分分析法和隶属函数法均可用于评价红锥二代优良家系。对比本研究前期对生长研究结果苗高（B2、A7、B5、A8、P3、B4、A6、R4、D2和R3）、地径（B2、A7、B5、P3、P2、A3、R4、D2、A6和A2）排名前10位的家系可以看出，生理指标与苗高、地径排名前10的家系重复率均达到60%以上。说明利用光合碳氮同化过程中关键物分析红锥优良家系的苗期选择具有一定的可行性。

本研究采用9个光合碳氮同化过程中关键生理生化指标，对红锥优树二代家系进行苗期选择，其结果与后期家系生长表现是否密切相关，还有待进一步验证。在未来研究中，将持续观测其他生长及生理生化指标（如树高、胸径、材积、光合等），进一步优化评价体系，以便更好地探讨红锥苗期选择的可靠性。

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