筛选microrr-15a-IRAK2调控预测奶牛对金黄色葡萄球菌性乳腺炎的反应

谈为忠 陈志

摘要：奶牛乳腺炎是一种非常复杂的疾病。研究表明，miRNA（微小核糖核酸）通过靶向靶基因影响乳腺炎，单miRNA-mRNA联合分析未能完全解释金黄色葡萄球菌对乳腺炎的影响。本研究成功建立了中国荷斯坦奶牛金黄色葡萄球菌乳腺外源性感染的乳腺炎模型。从感染金黄色葡萄球菌的健康乳腺组织中提取总RNA，应用Affymentrix技术对乳腺炎基因的差异表达进行了评价。结果显示：共有1230个不同表达的mRNA。一部分受影响的基因通过Q-PCR进行了验证。对差异表达基因进行通路分析。采用生物信息学技术预测和分析差异表达miRNA与mRNA之间的相关性。结果显示：共有329对负相关miRNA/mPNA，其中31对mRNA上调，298对mRNA下调。通过westemBlot和荧光素酶报告基因分析，评价miR-15a和白细胞介素-1受体相关的激酶样2（IRAK2）的差异表达。miR-15a和miR-15a靶基因（IRAK2）构成一个潜在的miRNA-mRNA调控对，可以作为预测乳腺炎反应的生物标志物。

关键词：乳腺炎;金黄色葡萄球菌;miP，-15a;IRAK2

乳腺炎是奶牛经常发生的一种疾病，该病可对奶牛健康造成严重危害，降低奶牛产奶质量。金黄色葡萄球菌（S.aureus）是引起奶牛乳腺炎的主要病原体之一。金黄色葡萄球菌不是乳腺专性寄生菌，但它可以定值于乳头、乳房、扁桃体、阴道以及躯体其他损伤部位的皮肤上，金黄色葡萄球菌在牛群中一旦传播便很难根除，主要引起慢性感染且易对常见的抗生素产生耐药性。其传播方式可分为平行传播和垂直传播，当挤奶程序不当，挤奶设备不良，乳头有损伤时金黄色葡萄球菌就会入侵乳腺组织，经挤奶工的手或挤奶设备进行平行传播;还可以通过给犊牛饲喂含病牛乳腺炎的乳汁进行垂直传播。蚊虫叮咬刺激乳头等也可引起产犊母牛感染金黄色葡萄球菌，同时，蚊蝇叮咬和环境不卫生等因素可促进金黄色葡萄球菌性乳腺炎的大量发生，并降低奶牛的产奶量。

金黄色葡萄球菌附着在宿主细胞和组织上，能够逃避宿主的免疫反应，释放破坏组织结构的毒素。金黄色葡萄球菌对多种抗生素敏感，但也能获得耐药性。因此，金黄色葡萄球菌的研究对奶牛乳腺炎的致病性具有重要意义。尽管近几十年来对金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的作用机制进行了大量的研究，但最近的研究主要集中在单基因分析或基因功能的验证上。因此，缺乏利用多组学分析和分子调控的综合研究。基因芯片技术能允许同时分析成千上万个基因在特定组织或细胞中的表达模式，从而为细胞机制研究提供更广阔的前景。本研究以金黄色葡萄球菌乳腺炎为研究对象，采用Affymetrix牛基因组表达微阵列技术，对其基因表达谱进行研究。随后，构建了miRNA-mRNA调控网络图，为今后奶牛乳腺炎的耐药性研究提供了实验基础。

一、材料和方法

（一）菌株的选择

选用扬州大学奶牛场的3头健康中国荷斯坦奶牛作为研究对象。单个金黄色葡萄球菌菌落（编号：ATCC29213），来自扬州大学兽医学院在实验前生长至1x107 CFU/mL金黄色葡萄球菌密度。每头奶牛都选择了相同的两个产奶区域作为测试对象22/5000。实验组1例金黄色葡萄球菌，对照组1例PBS。将上述悬浮液或磷酸盐缓冲盐水5mL，用针管注入奶牛乳头管。

（二）实验性乳腺炎病理檢查

乳腺组织脱蜡。洗涤15min后HE染色。去除染色部分以确保二甲苯不干燥。凝固后观察切片。

（三）RNA提取

组织提取总RNA和DNase（脱氧核糖核酸酶），按照制造商的说明书进行处理。合格的RNA样本将用于后续研究。

（四）测序分析

采用Gene Spring 11.0软件对质量控制合格数据（MAS5.0）进行标准化处理。差异表达基因分别采用t检验分析、通路分析和层次聚类分析。目的是筛选和探索与金黄色葡萄球菌性乳腺炎相关基因及其生物学意义。

（五）RT-qPCR和Western blot（蛋白质印迹法）分析

采用S-Poly（T）法测定成熟miR-NA表达水平。0.5ug高质量总RNA用于cDNA反转，使用RT试剂盒，miR-NA的相对表达量采用2-△ACt计算。Western blot（蛋白质印迹法）：使用RIPA buffer裂解细胞。通过SDS-PAGE对蛋白进行琼脂糖凝胶电泳。实验使用的抗体有：单克隆抗IRAK2和单克隆B-catin（Proteintech Gronup，66009，中国）。用化学发光ECL West-ern blot系统检测信号（Pierce，USA）。

（六）细胞培养和转染

根据之前的研究，对牛乳腺上皮细胞（BMECs）进行了培养和分离。根据制造商的说明，使用Lipofectami-BeTM RNAiMAX（Invitrogen，美国）将细胞转染miR-15a模拟物（60nm）或抑制剂（60nm）（Invitmgen，美国）。转染48h后收集细胞。

（七）荧光素酶报告实验

构建一个包含miRNA靶向IRAK2基因的目标位点的载体psi-CHECK-2，该载体由Not和Xho酶切后插入，随后检测荧光活性。所有的结构均通过测序验证。

（八）统计分析

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。数据以三个独立实验的均值±标准差表示。采用方差分析，以*p<0.05、**p<0.01为差异有统计学意义。

二、结果

（一）病理改变及组织学

奶牛乳腺感染金黄色葡萄球菌后，取健康组和金黄色葡萄球菌组乳腺组织切片并进行HE染色。400倍镜下观察乳腺组织，发现对照组有一个完整的充满牛奶的腺泡腔。腺泡腔间组织致密完整，乳管正常（见图1A）。相反，对金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺组织的检查显示，在腺泡腔内积聚了大量的炎性粒细胞。腺泡壁较薄，甚至破裂或严重变形，泌乳管发生严重充血，提示临床乳腺炎情况（见图1B）。

（二）转录组分析

1、芯片杂交扫描：芯片杂交后得到的荧光强度图像大致可以反映出芯片的杂交状态。本实验荧光强度图亮度高、密度大、均匀且清晰度好。实验证明，该方法达到了实验要求，杂交效果良好。

2、基因芯片数据处理：在生物可重复性的情况下，即火山图可以直观地显示两组样本间差异表达的基因。这些映射在一个图中显示了两个重要的度量（折线变化，p值），被用来表达基因明显不同的金黄色葡萄球菌组和健康组（见图2）。在这项研究中，共有1230个基因，超过2倍的倍数，由763个基因调节，537个基因表达下调（Fc>2，P<0.05）。

3、差异基因表达通路分析：本研究利用功能注释工具对差异表达基因进行通路分析，共筛选出15条与免疫相关的重要通路，这些通路均来自差异显著的基因。这些通路是良好的功能指标，可以进一步研究（见图3）。

差异表达基因的Q-PCR验证：从差异表达基因中筛选出8个基因进行荧光定量PCR分析。结果表明，这些基因的差异表达显著（P<0.05），且趋势与chip结果一致（见图4）。结果表明，基因芯片分析结果可信。

（三）miR-15a特异性靶向IRAK2

选择miR-15a和IRAK2验证其调控关系。软件Targetscan利用3’-UTR相互分配，识别潜在的调控miRNA。发现IRAK2在3’-UTR中有一个miR-15a结合位点，因此，推测IRAK2可能是miR-15a的atarget基因（见图5B）。结果显示：miR-15a抑制上调了IRAK2的表达，而过表达miR-15a的细胞则下调了IRAK2的表达（图5A，图5D）。为了证明miR-15a直接靶向IRAK2，课题组合成了一个包含miR-15a靶向位点IRAK2的3’-UTR片段。该片段被克隆到一个psi-CHECK2-载体中，构建一个3’-UTR报告质粒。荧光素酶报告基因检测显示，miR-15a过表达降低了野生型报告基因3’-UTR的相对荧光素酶活性。然而，突变报告基因的相对荧光素酶活性没有显著差异（见图5C）。这些结果表明：miR-15a直接靶向IRAK2 mRNA位点，并发挥负调控作用。

A：将miR-15a模拟物或抑制剂转染CMECs 48h;采用RT-qPCR法定量IRAK2表达水平（n=6）。灰色条代表负控制;黑条表示miR-15a模拟物或抑制剂。B和C：miR-15a在IRAK2’-UTR中的靶位点以及荧光素酶（Luc）表达载体的构建与IRAK2 3’-UTR融合。WT表示带有WTIRAK2 3’-UTR（684～691）的Luc报告向量;MU表示IRAK2 3’-UTR中miR-15a位点突变的Luc报告载体。D：Western blot分析miR-5a模拟物和NC处理实验中IRAK2表达情况。western blot分析miR-15a模拟物和抑制剂对IRAK2蛋白表达的影响。转染48h后，分别获得总蛋白。

三、讨论

动物疾病模型的建立是人为的。这一过程使动物在一定的致病因素作用下，破坏一定的组织、器官或整个身体，导致功能、代谢和形态结构的一些变化，进而引发各种疾病。本研究利用金黄色葡萄球菌感染奶牛，建立乳腺炎模型，为乳腺炎的免疫和病理反应研究提供参考，为乳腺炎的临床治疗提供依据。奶牛乳腺炎的病因众多，致病微生物感染是其发病的主要因素。金黄色葡萄球菌对抗生素有很强的耐药性。为确保乳腺炎模型能够成功构建并符合统计标准，课题组选取了3头奶牛，均来自同一奶牛场，在相同的饲养管理条件下，年龄、胎次、体重相同，产奶量相近，身体状况良好。此外，这些奶牛的SCC必须低于100 000/mL，并且在牛奶中培养的细菌呈阴性。通过对奶牛进行的实验，发现1x10CFU/mL浓度的抑菌液5mL对细菌是有效的。

乳腺炎作为奶牛的常见病，对奶牛行业造成了严重的危害。为了更好地解决这一问题，在分子水平上阐明乳腺炎免疫反應的相关控制机制尤为重要。已知miRNA通过对特定靶基因的作用来协调疾病反应的某些方面。事实上，一些miRNA在应对细菌感染时的免疫调节中发挥重要作用。之前，Li R等人对金黄色葡萄球菌进行了相关miRNA测序分析。LiR等人使用非配对测试完成了数据分析。将组样本合并为2个生物复制体。此外，LiR等使用Audic_Claverie公式计算p值。以p值<0.05和TPM差异倍数>2为阈值，选择差异表达miRNA。本文采用6个样本，每组比较3个样本。此外，本文根据样本配对测试分析，使用DESeq2软件的配对测试算法。该试验采用一对一配对进行鉴别筛选。所选mima p值<0.05，TPM差异倍数为>2。样本量不同，之前的分析为2个样本，现在的分析为6个样本。对于之前的研究，本组没有重复计算，本研究是根据本组3次重复计算，样本是成对的。金黄色葡萄球菌感染共导致1230个基因表达差异。其中763个基因上调，537个基因下调。这些基因包含研究最多的乳腺炎抗性基因：白细胞介素和白细胞介素受体基因IL6、IL17A和CXCRl。IL-6是一种多功能炎症细胞因子，是机体细胞因子网络的关键成员。该细胞因子在炎症反应中起重要作用，是由212个氨基酸组成的糖蛋白。IL-6具有多种生物学功能，在淋巴细胞、炎症和免疫反应中发挥重要作用。本实验中IL-6也明显上调，推测IL-6在金黄色葡萄球菌感染奶牛炎症过程中发挥免疫调节作用。CXCRl主要在中性粒细胞和单核细胞中表达，介导中性粒细胞的活化。该细胞因子促进贮藏酶的释放，增强吞噬作用，引起机体局部炎症反应，从而起到杀灭致病菌的作用。在本研究中，感染金黄色葡萄球菌的奶牛体内CXCRl的表达明显高于对照组。本研究还证实了先前CXCRl与奶牛乳腺炎的相关性。CXCRl可能是奶牛抗乳腺炎的重要候选基因。

miRNAs及其靶基因的生物学分析可以为我们研究金黄色葡萄球菌感染乳腺组织引起的乳腺炎的免疫调节过程提供良好的方法。通过比较感染金黄色葡萄球菌和对照组织中miRNA和mRNA的表达谱，可以发现与奶牛乳腺炎发生相关的关键miRNA和mRNA。由此产生的miRNA/mRNA对参与了广泛的生物学功能。IRAK2基因在金黄色葡萄球菌组中显著上调，属于丝氨酸，苏氨酸激酶家族的白细胞介素-1受体相关激酶（IRAKs）。其主要作用是在炎症细胞因子白细胞介素一1（IL-1）上调时与白细胞介素受体（IL-IR）结合。IRAK2、IRAKM、IRAK-Ib、IRAKlc在IRAK家族中为TLR信号通路负调控。研究表明，IRAK2具有显著的负调控功能，可以减少LPS诱导的肥大细胞凋亡。同样，miR-15a参与多种调节炎症和免疫细胞分化的功能。荧光素酶报告基因检测结果显示：miR-15a显著抑制荧光素酶活性，提示miR-15a对荧光素酶活性具有抑制作用。此外，通过改变miR-15a在3’UTR中的潜在结合位点，可以消除miR-15a对IRAK2的3’UTR的抑制作用。综上所述，课题组推测miR-15a可以靶向并抑制IRAK2。本研究获得的miRNA-mRNA调控对金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺炎可能起到重要作用。因此，未来的研究可以为评估细菌感染引起的乳腺炎的免疫反应和相关控制机制提供参考。这些信息对于制定治疗奶牛乳腺炎的策略可能具有一定的价值。