虎杖-乳香的有效组分配伍对慢性非细菌性前列腺炎NOD小鼠的药效学评价研究

高瑞松 刘慧英 田雪飞 滕永杰 贺勇凯 王帅 熊伟 林群芳 周青

[摘要]目的探讨大黄素、虎杖苷、乳香挥发油配伍对非肥胖性糖尿（non-obese diabetic，NOD）小鼠慢性非细菌性前列腺炎发挥治疗作用的最佳配比。方法正常雄性NOD小鼠220只，按照L8（2⁷）正交表随机分为8组，另设立阳性对照组、模型组、空白对照组，共11组，每组20只。按组别给予相应干预，酶联免疫吸附法（cnzyme-labeled immunosorbent assay，ELISA）检测NOD小鼠前列腺组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-αTNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，lL-1β）、白介素-6（interleukin-6.1L-6）、白介素-10（interleukin-10.IL-10）含量的变化，并结合苏木素-伊红（haematoxylin-eosin，HE）染色法评价前列腺组织病理改变程度，明确大黄素、虎杖苷、乳香挥发油的最佳配比与量效关系。结果正交实验极差结果显示各因素影响强弱依次为虎杖苷>大黄素>乳香挥发油，方差分析结果发现虎杖苷、大黄素、乳香挥发油对疗效的影响具有统计学意义（P<0.01.P<0.05）。大黄素、虎杖苷、乳香挥发油的最佳配比为大黄素0.1g/kg虎杖苷04g/kg乳香挥发油0.4g/kg。结论大黄素、虎杖苷、乳香挥发油的最优比例配伍具有减轻慢性非细菌性前列腺炎动物模型炎症的疗效，乳香挥发油与虎杖苷之间具有协同作用。

[关键词]大黄素;虎杖苷;乳香挥发油;前列腺炎

[中图分类号]R285.5;R697+，33[文献标志码]A [文章编号]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.004

血-前列腺屏障系统是临床治疗慢性前列腺炎效果欠佳的重要原因。前期研究中，我们发现乳香可促进虎杖等清热利湿药对慢性前列腺炎大鼠前列腺组织炎性细胞浸润程度的改善及腺上皮结构修复的功效。临床研究也表明，配伍了芳香开窍中药的加味虎杖散治疗男性慢性前列腺炎效果佳。进一步的研究表明，乳香可增加前列腺上皮细胞的通透性，调节屏障相关的细胞连接蛋白ZO-1、Claudins蛋白表达的作用，并且不同剂量的乳香对蛋白表达的影响具有差异性。因此我们推测乳香、虎杖的最优化剂量配伍，可进一步提高药物对慢性前列腺炎的治疗效果。而中药乳香、虎杖的主要抗炎成分是乳香挥发油、大黄素和虎杖苷等。为此，我们采用正交设计方法对3种有效成分进行了治疗慢性前列腺炎NOD小鼠的药效学评价研究，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康SPF级非肥胖性糖尿（non-obese diabetic，NOD）小鼠220只，雄性，6周龄，体质量20-30g;SPF级SD大鼠4只，雄性，体质量240-300g，由中南大学实验动物学部提供许可证号：SCXK（湘）[2016-0002]。

1.1.2主要试剂 百白破疫苗（批号：201611068-2）购自湖南省疾病预控制中心：大黄素（批号：20180207384）：虎杖苷（批号：20180417159），质量分数均为98%，均来自北京索莱宝科技有限公司：乳香购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科：塞来昔布（规格200mg/粒，瑞辉制药有限公司）：CFA完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司;BCA蛋白定量试剂盒购自中国北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器 352型酶标仪（Labsystems Multi-skan MS，芬兰）;AC8洗板机（Thermo Labsystems，芬兰）。

1.2实验方法

1.2.1模型制备 参照文献方法制备前列腺组织抗原。取雄性SD大鼠4只，处死后分离前列腺组织，剪碎后加入含0.5%TritonX-100及蛋白酶抑制剂的PBS中置冰上匀浆，10000r/min 4℃离心10min，取上清液。BCA法測定蛋白含量后，蛋白提纯液用PBS溶液稀释至1.0mg/mL浓度，-80℃冰箱保存备用。参照文献方法制备NOD小鼠慢性非细菌性前列腺炎模型：前列腺蛋白提纯液按1：1加入CFA完全弗氏佐剂乳化，第0天和第15天进行NOD小鼠的多点皮下注射（每点注射0.5mL，左脚垫、右脚垫、尾根部基部、左肩胛、右肩胛），同时腹腔注射百白破疫苗0.1mL。第21天时每组处死2只NOD小鼠，分离前列腺组织，经病理学验证，间质及腺腔内可见明显的中性粒细胞浸润，腺腔内有大量脱落细胞及少量炎性细胞，造模成功。

1.2.2药物制备 按照2010年版《中华人民共和国药典》附录XD中水蒸气蒸馏法提取乳香挥发油。大黄素、虎杖苷、乳香挥发油配伍混悬液临用前配制，按组别要求以0.5%的羧甲基纤维素钠为助溶剂配制大黄素、虎杖苷、乳香挥发油的配伍混悬液，并在室温下充分搅拌30min以上。

1.2.3三因素二水平正交设计 将中药有效成分大黄素、虎杖苷、乳香挥发油分别按照不同比例配伍，通过采用3因素即A大黄素、B虎杖苷、C乳香挥发油，2水平即低、高2个剂量的正交表L8（2⁷）进行设计，主要考察A、B、C三个因素在治疗慢性前列腺炎疗效中的主次作用，同时考虑乳香挥发油分别与大黄素、虎杖苷之间的一级交互作用，对虎杖一乳香有效成分配伍进行优选。优选结果为8组药物浓度：分别为A₁B₁C₁（正交1组）、A₁B₁C₂（正交2组）、A₁B₂C₁（正交3组）、A₁B₂C₂（正交4组）、A₂B₁C₁（正交5组）、A₂B₁C₂（正交6组）、A₂B₂C₁（正交7组）、A₂B₂C₂（正交8组）。见表1。

1.2.4动物分组及干预 正常雄性NOD小鼠220只，随机分为11组：按照L8（2⁷）正交表分8组（正交1组-正交8组），分别予以相应干预措施，并设立阳性对照组、模型组、空白对照组，每组20只。大量临床及文献验证塞来昔布作为目前治疗慢性前列腺炎的西药疗效确切，因此，本实验选择塞来昔布为阳性对照药。根据人和动物体表面积换算方法，阳性对照组给予塞来昔布0.02g/kg，空白对照组及模型组给予等容量蒸馏水灌胃。抗原注射22d时开始灌胃，连续灌胃14d后处死，分离前列腺组织置-80℃冰箱保存待测。

1.2.5检测指标 （1）病理学HE染色：NOD小鼠前列腺组织HE染色后光镜下观察病理学改变及炎症浸润情况，根据前列腺炎组织学诊断标准，病理学分级标准制定病变情况分级标准，通过等级资料分析判定病变程度;（2）炎症因子检测：采用酶联免疫吸附试验ELISA法，检测NOD小鼠前列腺组织匀浆中炎症因子、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-10（inter-leukin-10，IL-10）的含量变化。

1.3统计处理

等级资料采取秩和检验，计量资料用“x±s”表示，组间比较若满足正态性及方差齐性则采用成组t检验，若不满足则采用秩和检验，通过正交极差分析、方差分析法对实验结果进行统计学分析。以P<0.05为有差异统计学意义。

2结果

2.1前列腺组织病理学检测

空白组前列腺组织腺体分布及腺泡形态数量正常，未见炎细胞浸润：模型组前列腺组织腺泡数量减少，凝固体少见，腺上皮局灶性坏死脱落，腺腔内有大量炎性细胞及脱落的腺上皮细胞，间质内可见较多中性粒细胞细胞浸润：阳性对照组前列腺腺体分布及排列基本正常，间质轻度增生，可见少量炎细胞浸润。正交1-8组：正交2、4、6、8组腺体分布及排列基本正常，可见少量中性粒细胞浸润：正交3、5、7组腺腔分泌物内见少量脱落细胞及腺上皮脱落，间质内轻度中性粒细胞浸润：正交1组间质内可见明显的中性粒细胞浸润，腺腔内有大量脱落细胞及少量炎性细胞。

2.2各组NOD小鼠前列腺组织病变程度比较

参照前列腺炎组织诊断标准和病理学分级标准进行评分和计数，根据秩均值排序对各组NOD小鼠前列腺组织病变程度进行分级并评价。方差分析结果显示差异有统计学意义（x²=158.466.P=0.000），根据秩均值排序，发现正交8组及阳性对照组NOD小鼠前列腺组织病变程度低于模型组，阳性对照组及正交2、4、6组的炎症程度相对较低，秩均值较低，空白组前列腺组织无病变，秩均值最高。结果见表2。

2.3正交试验结果分析

2.3.1直观分析 我们采用ELISA法检测了各组前列腺组织匀浆中炎症因子IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α含量变化。结果显示，各因素对IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α影响的顺序为虎杖苷>大黄素>乳香挥发油，最佳配比方案为A₁B₂C₂，数据结果显示，低剂量的大黄素有抗炎效果，而高剂量的大黄素反而炎症控制不佳，故大黄素优选出1水平：使用高剂量的虎杖苷能促进疗效，使炎症水平降低，故优选出虎杖苷2水平。根据炎症因子IL-1B、IL-10、IL-6、TNF-α含量，将各正交组分别与模型组、阳性对照组进行组间比较分析，结果显示正交2、4、6、8组及阳性对照组与模型组相比较，组间差异有统计学意义（P<0.05.P<0.01）。结果发现：（1）正交2.4.6.8组均为乳香揮发油高剂量组（P<0.05，P<0.01），说明高剂量乳香挥发油对炎症水平调控更优：（2）高剂量水平的虎杖苷显示出更强的改善炎症状态的作用;（3）正交5、6、7、8组均含有高剂量大黄素，与模型组进行组间比较，其中正交5、7组P值均大于0.05.说明治疗效果不明显：而正交6、8组包含有高剂量乳香挥发油，与模型组进行组间比较，其P值均小于0.01.说明疗效良好。以上结果显示高剂量大黄素反而加重炎症反应，增加炎症因子的含量，而高剂量大黄素在高剂量乳香挥发油的拮抗作用下，可提高中药抗炎作用。结果见表3、表4。

2.3.2方差分析 未考虑交互作用的前提下，方差分析结果显示，各因素影响大小顺序：虎杖苷>大黄素>乳香挥发油。说明因素A与因素B的含量高低对炎症因子的含量变化具有更直接的影响。见表5。

2.3.3交互作用分析 综合乳香挥发油与大黄素、乳香挥发油与虎杖苷之间的交互作用，通过分析4个观察指标值，通过四格表计算，发现（B+C）效应大于B和C单用效应，故二者合用存在协同作用;（A+C）效应小于A和C单用效应，故二者合用存在拮抗作用。分析结果说明，因素C乳香挥发油与因素B虎杖苷间具有协同交互作用，提示乳香挥发油能促进虎杖苷疗效：因素C乳香挥发油与因素A大黄素间具有拮抗交互作用，提示乳香挥发油能抑制高剂量大黄素副作用。同时BxC交互作用显著，而AxC交互作用不显著，提示因素C乳香挥发油与因素B虎杖苷的交互作用对炎症因子水平的影响显著。见表6。

3讨论

中医药治疗慢性前列腺炎具有一定优势，如何进一步提高中医药治疗慢性前列腺炎的疗效，是临床研究者们一直关注的问题。根据慢性前列腺炎“败精瘀阻”的中医病机，结合前列腺特殊的组织结构及屏障功能特点，围绕“不通”的病理本质，我们将芳香开窍药物用于促进慢性前列腺炎的中药治疗方案中，取得了很好的疗效，并发现芳香开窍药乳香促进前列腺上皮屏障通透性可提高虎杖的疗效。为了探讨芳香开窍药物促进清热利湿药物配伍规律的物质基础，我们进一步对乳香及虎杖主要的有效活性成分进行了分析与研究，通过正交设计对他们的最佳配伍模式进行了探讨。

虎杖中的主要有效成分包括蒽醌类和芪类，其中具有抗炎作用的主要成分有大黄素、虎杖苷。据报道，虎杖中的蒽醌类组分大黄素具有抗菌消炎、抗肿瘤、免疫抑制等药理作用。其中抗炎抗氧化作用在慢性前列腺炎的治疗中具有更重要的意义。在对抗局部急性炎症时，大黄素能发挥强有力的作用，对核转录因子和黏附分子的表达有明显的抑制作用，因此，可治疗多种炎症，并可通过抑制巨噬细胞分泌TNF-α来抑制过度的炎症反应，还能抑制由内毒素诱导的TNF-α、IL-10、IL-6、IL-8等炎症细胞因子的分泌，对免疫激活机制进行影响。而虎杖苷可通过抑制炎症介质释放，降低TNF-α、IL-6等含量发挥抗炎作用。

本研究组前期研究充分证明了虎杖治疗慢性前列腺炎的有效性以及芳香开窍药乳香等的促前列腺上皮屏障通透性提高虎杖疗效的作用。本研究中，我们选择了虎杖中的有效成分大黄素、虎杖苷作为研究因素，并与乳香挥发油进行组合来探讨虎杖、乳香中有效成分治疗慢性前列腺炎的配伍规律，通过综合分析各治疗组NOD小鼠模型前列腺组织病理及组织匀浆中丁NFF-α、IL-1B、IL-6、IL-10水平变化，发现虎杖、乳香的有效成分配伍具有良好的控制炎症作用。直观分析及方差分析表明，大黄素、虎杖苷、乳香挥发油三因素最佳配比水平为A₁B₂C₂，即大黄素为1水平0.1g/kg、虎杖苷为2水平0.4g/kg、乳香挥发油为2水平0.4g/kg疗效更好。此外还发现，高剂量大黄素使用反而加重炎症反应，我们推测可能源于大黄素具有泻下作用，与过用伤正气，反而造成免疫紊乱，加重炎症反应有关。虎杖苷的作用相对温和，对炎症反应的调控表现出剂量依赖性，高剂量水平的虎杖苷显示出更強的炎症改善作用。

三因素大黄素、虎杖苷、乳香挥发油，对NOD小鼠慢性非细菌性前列腺炎治疗作用的影响大小顺序为虎杖苷>大黄素>乳香挥发油，提示在治疗中发挥最主要作用是虎杖苷。根据报道，无论在体内还是体外，虎杖苷都能够通过调节细胞内炎症因子的表达水平，例如通过阻断TNF-α、IL-6和IL-1B的表达等方式，从而减轻细胞受到的炎症损害，这跟本研究结果基本相一致。

通过考察三因素大黄素、虎杖苷、乳香挥发油之间的交互作用，发现乳香挥发油与虎杖苷之间具有协同作用，而与大黄素之间具有拮抗作用。乳香挥发油的这种作用，我们推测与其前列腺屏障相关蛋白的调节作用有关，可影响前列腺腺泡及上皮细胞连接的通透性，从而发挥与虎杖苷及大黄素之间的协同或拮抗作用。

综上所述，中药虎杖、乳香中有效成分大黄素、虎杖苷、乳香挥发油按优化比例配伍使用具有改善NOD小鼠慢性前列腺炎模型前列腺组织炎症状态的作用。