六神丸治疗大鼠放射性肺炎的机制研究

郑琦 侯炜 王家伟 王雪凯 樊慧婷 林洪生

摘要 目的：观察六神丸对放射性肺炎大鼠的治疗作用，对其血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1進行检测，探究六神丸对放射性肺炎的治疗作用及可能的分子机制。方法：将40只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、激素组、六神丸组，采用直线加速器对除正常组外的3组大鼠进行全胸单次照射，剂量为16 Gy。照射24 h后各组进行给药。照射后第4周，处死动物。取全肺称重计算肺系数;进行HE染色。采用Luminex法检测大鼠血清中细胞因子的表达。结果：与正常组比较，照射后大鼠肺系数显著升高（P<0.05），使用激素或六神丸干预后，大鼠肺系数较模型组低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。HE结果显示激素组、六神组大鼠肺组织出现充血、水肿、渗出等炎性病理学改变均较模型组有改善，炎细胞浸润也不同程度减轻。六神丸可显著下调大鼠血清中IL-1β、TNF-α炎性反应因子的表达（P<0.05，P<0.01）。结论：放射性肺炎大鼠血清中炎性因子明显增加的增加，六神丸可有效减轻放射性肺炎大鼠局部肺损伤的程度，其机制可能与下调血清中TNF-α及IL-1β相关。

关键词 六神丸;放射性肺炎;TNF-α;IL-1β

Mechanism of Liushen Pills in Treating Rats with Radiation Pneumonitis

Zheng Qi， Hou Wei， Wang Jiawei， Wang Xuekai， Fan Huiting， Lin Hongsheng

（1 Oncology Department， Guang′anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract Objective：To observe the effects of Liushen Pills on IL-1β， IL-6， TNF-α and TGF-β1 in the serum of rats with radiation pneumonitis（RP）， and explore the therapeutic effect of Liushen Pills（LS）on RP and the possible molecular mechanism.Methods：A total of 40 male SD rats were divided into a normal control（NC）group， a model group， a prednisone acetate（PA）group， a LS group， randomly.Linear accelerator irradiated in the 3 groups except the NC group for single chest with the dose of 16Gy in rats.The rats in each group were given the drug by perfusion 24 hours after irradiation.After 4 weeks， the rats were sacrificed.The lung coefficient was calculated by weighing the lungs.The pathological changes in the lungs were observed by hematoxylin-eosin staining.The expressions of cytokines in serum of rats were detected by Luminex.Results：Compared with the NC group rats， the lung coefficient of model rats were significantly increased（P<0.05）， while the lung coefficient of PA-treated and LS-treated rats were markedly decreased compared with the model rats， and the difference was statistically significant（P<0.05， P<0.01）.The HE results showed that the PA-treated， LS-treated rats inflammatory lesions such as congestion， edema， and exudation were lighten than model rats in lung tissues.Liushen Pills could significantly decreased the expressions of IL-1β， TNF-α in the serum of rats（P<0.05， P<0.01）.Conclusion：The proinflammatory cytokines in the serum of rats with RP were increased.Liushen Pills can effectively reduce lung injury in rats with RP， which may be related to the down-regulation of TNF-α and IL-1β in serum.

Key Words Liushen Pills; Radiation pneumonitis; TNF-α; IL-1β

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.016

放射性肺损伤（Radiation-induced Pulmonary Injury，RPI）是胸部肿瘤（如肺癌、乳腺癌等）经放射治疗后常见的并发症，其不仅直接影响放射治疗肿瘤的疗效，还会增加放射后的各种迟发性损伤，严重的影响着患者的生命质量。RPI主要包括放射性肺炎（Radiation Pneumonitis，RP）及放射性肺纤维化（Radiation Pulmonary Fibrosis，RPF）[1-2]。近年来，中医药因其疗效显著、不良反应低等优势，在防治RPI中的作用越来越受到关注[3-4]。有学者采用养阴清肺、清热解毒、活血化瘀等治法治疗RPI，在减轻放疗的不良反应方面，显示出了明显的优势，对治疗RPI具有积极的意义[5]。六神丸出自《雷允上诵芬堂方》，现由常熟雷允上制药有限公司生产。六神丸的应用至今已有100多年的应用历史，其功效为清热解毒、消肿止痛。近年来，其抗肿瘤作用在临床和实验研究中得到广泛认可[6]。本研究观察了中药名方六神丸对RPI的影响，并对大鼠血清中IL-1β、TGF-β1、IL-6和TNF-α的含量进行检测，目的在于探究六神丸是否能够防治RPI并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国中医科学院广安门医院实验动物中心，卫生许可证号：SYXK（京）2014-0041。清洁级，采用常规灭菌饲料，22～25 ℃，自动光控（12 h明/12 h暗）。

1.1.2 药物 六神丸由常熟雷允上制药有限公司提供，生产批号：15111125。醋酸泼尼松龙注射液由华中药业股份有限公司提供，国药准字H42021216，生产批号：20151001。以注射用生理盐水将注射液分别稀释100倍和200倍，制成浓度为0.25 mg/mL和0.125 mg/mL的水溶液。

1.1.3 仪器与试剂 Precise型医用直线加速器（瑞典医科达公司，型号：Elekta Limited）;病理切片机（德国莱卡公司，型号：RM2235型）;NIKON显微镜及成像系统（日本尼康公司，型号：NIKON TE2000-U）;液体芯片仪（美国Luminex公司，型号：MAGPIX）水合氯醛（北京国药集团化学试剂公司，批号：20160715）;ProcartaPlex Rat IL-1beta试剂盒（批号：EPX01A-36002-901）、ProcartaPlex Rat IL-6试剂盒（批号：EPX01A-36053-901）、ProcartaPlex Rat TNF-alpha试剂盒（批号：EPX01A-30622-901）、ProcartaPlex Rat TGF-beta1试剂盒（批号：EPX01A-30420-901）、ProcartaPlex Rat Basic Kit（批号：EPX010-30420-901）以上试剂均购于美国eBiosinece公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 建立大鼠RP模型SD雄性大鼠，40只，随机分为正常组、模型组、激素组、六神组，共计4组，每组10只。所有动物在北京中医药大学第三附属医院进行造模，造模方法如下：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛，3 mL/kg麻醉。将大鼠腹面朝上，四肢固定于自制固定器，充分暴露胸部，采用6MV-X线加速器单次全胸照射，剂量为16 Gy。照射面积约为3.5 cm×4.0 cm（上至两腋窝、下至胸骨剑突，其余部分用10 cm厚铅砖屏蔽），距源靶一米进行照射，剂量率为250 cGy/min，实验组大鼠全胸照射劑量共计16 Gy，正常组大鼠在同等条件下肺部假照射0 Gy。

1.2.2 干预方法 所有动物于照射后第1天开始给药，1次/d，连续至照射后第28天取材。按动物体质量变化，每周调整1次灌胃剂量，按1 mL/100 g/d给药。六神组：灌胃给药，给予0.057 g药粉/（kg·d）生药药液，1次/d;激素组：腹腔注射给药，给药剂量按时间依次递减，第1～2周予泼尼松水溶液剂量为1.25 mg/（kg·d），第3周予泼尼松水溶液剂量为0.625 mg/（kg·d），第4～8周予生理盐水;模型组：灌胃给药，生理盐水，1次/d;正常组：灌胃给药，生理盐水，1次/d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 动物取材 于照射后4周（第28天），取各组大鼠，每组10只，称重后进行麻醉。麻醉时，腹腔注射10%水合氯醛，3 mL/kg，四肢固定于木板上，打开腹腔，分离腹主动脉，自腹主动脉取血，静置2 h后离心，取上清存于-80 ℃冰箱。摘取大鼠全肺称重，将肺叶存于福尔马林液中浸泡待用。

1.2.3.2 计算肺系数 按照以下公式计算肺系数：肺系数（%）=肺湿重（mg）/末次体质量（g）×100%。

1.2.3.3 观察肺组织病理学改变 取左下肺叶，浸泡于10%中性福尔马林组织固定液中，固定时间大于48 h。进行脱水→浸蜡→包埋→切片→脱蜡等步骤，用苏木素-伊红进行染色（HE染色）。在光学显微镜下，观察肺组织HE染色切片的病理改变。

1.2.3.4 Luminex法检测大鼠血清中的细胞因子 按照试剂盒说明书进行操作。准备标准品，绘制标准曲线。准备微球及样品，并于96孔板上孵育2 h。洗板后分别加入检测抗体IL-1β、TGF-β1、IL-6和TNF-α孵育30 min。洗板后加入SA-PE孵育30 min，上机检测并进行数据分析统计。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，实验结果以均值±标准误（±s）表示。所有数据均符合正态分布，多组间比较采用单因素ANOVA方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化 正常组大鼠体质量呈上升趋势，模型组大鼠体质量在造模后第14天，上升趋势减缓，至放射后第28天，体质量较之前无明显变化。激素组体质量呈上升趋势，至第28天，体质量较模型组高。六神组大鼠体质量呈上升趋势，在造模后第14～28天，体质量较模型组高。各组体质量变化见图1。

2.2 受照射后大鼠的临床表现 在照射后第1周，大鼠状态较正常组动物无显著性变化。照射后第2～4周，受照射大鼠照射部位毛质粗糙，整体皮毛逐渐开始不光泽，活动能力逐渐下降，体质量增长较正常动物缓慢;部分动物胸部出现脱毛甚至皮肤溃烂的情况。上述临床表现程度，模型组最为严重，六神丸和激素可减轻大鼠受照射后的临床症状。

2.3 各组大鼠肺组织标本变化 打开大鼠胸腔后，发现正常组大鼠肺组织形态完整，呈粉红色，表面光滑，有弹性。模型组大鼠有大量胸腔积液，双肺充血红肿，呈暗红色，肺部表面或整页肺组织布满点状出血，部分可见肺组织与胸腔粘连。六神组和激素组均较模型组肺组织肿大出血情况有明显改善，胸腔积液较少。

2.4 各组大鼠肺系数变化 于照射后第28天取各组大鼠，称重后处死取材。摘取大鼠全肺称重，肺湿重（mg）/末次体质量（g）×100%即为肺系数。正常组大鼠体质量增长明显，肺湿重无明显变化，其肺系数为：（3.45±0.06）%;中药组体质量变化不明显，肺湿重略有增加。计算其肺系数，结果显示，模型组肺系数为：（6.34±0.30）%。与正常组比较，模型组大鼠肺系数与明显增大，差异有统计学意义（P<0.001），激素组肺系数为（5.11±0.13），六神组肺系数为（5.68±0.18）%。与模型组比较，激素组和六神组的肺系数显著降低，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。见图2。

2.5 各组大鼠HE染色情况 染色后，正常大鼠肺组织结构正常，支气管壁完整，气管平滑肌未见增厚，黏膜上皮完整，肺泡形态较规则未见炎性细胞浸润。照射后模型组大鼠表现出急性炎性反应的变化，支气管管腔变狭窄，支气管平滑肌肥大加重，肺泡排列不规则且肺泡壁增宽，炎性渗出、水肿明显，肺泡结构紊乱，肺泡间隔增宽，肺间质及毛细血管壁充血，肺间质及肺泡腔内可见大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，黏膜上皮破损等。与模型组比较，激素、六神均可显著改善肺组织中充血、水肿、渗出等炎性病变，支气管平滑肌厚度不同程度降低，炎细胞浸润情况出现减轻。见图3。

2.6 各组大鼠血清中细胞因子的变化 采用Luminex法检测大鼠血清中的细胞因子IL-1β、TGF-β1、IL-6和TNF-α。结果表明，正常组、模型组、激素组、六神组大鼠血清中的IL-6含量分别为：（1.88±0.04）pg/mL、（1.75±0.09）pg/mL、（1.87±0.06）pg/mL、（1.77±0.05）pg/mL，各组织间比较差异无统计学意义。正常组、模型组、激素组、六神组大鼠血清中的TGF-β1含量分别为：（1 674.50±54.26）pg/mL、（1 613.42±226.52）pg/mL、（1 531.67±146.96）pg/mL、（1 697.92±167.45）pg/mL，各组织间比较差异无统计学意义。研究结果显示，正常组大鼠血清中的IL-1含量为（17.77±7.22）pg/mL，模型组大鼠血清中的IL-1含量为（75.36±13.96）pg/mL，與正常组比较，模型组大鼠血清中IL-1β的含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。激素组大鼠血清中IL-1β的含量为（63.15±14.05）pg/mL，较模型组低，但差异无统计学意义。六神组大鼠血清中IL-1β的含量为（15.09±5.46）pg/mL，与模型组比较，六神组大鼠血清中IL-1β的含量降低，差异有统计学意义（P<0.01）。研究结果显示，正常组大鼠血清中的TNF-α含量为（17.98±7.91）pg/mL，模型组大鼠血清中的TNF-α含量为（91.92±16.80）pg/mL，与正常组比较，模型组大鼠血清中TNF-α的含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。激素组、六神组大鼠血清中TNF-α的含量分别为（54.69±16.94）pg/mL、（42.21±22.01）pg/mL，与模型组比较，六神组大鼠血清中TNF-α的含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

3 讨论

RPI是胸部肿瘤放疗后常见的并发症，重症患者表现为因广泛的肺纤维化病变而致呼吸功能障碍甚至死亡，严重的影响了患者的生命质量及生存率[7]。目前，对于RPI的治疗，西医常采用大剂量激素加抗生素治疗，或采用抗氧化剂等药物，取得了一定的疗效，但其不良反应大，且预后不佳、安全性低，故寻找一种安全有效的药物，一直是科学研究中的重要课题。中医学认为，肺为娇脏，不耐攻伐。放射性损伤属于热毒，耗伤气血阴津，导致肺失濡养，故采用养阴清肺，清热解毒之方剂进行治疗[8]。本研究采用六神丸治疗RPI大鼠，六神丸具有清热解毒、消肿止痛之功，由牛黄、珍珠、蟾酥、明雄黄、麝香、冰片6味药配制而成[9]。研究显示，六神丸可以减轻RPI大鼠的临床表现，有效改善RP大鼠照射后的皮肤损伤，减少胸腔积液。与模型组比较，六神丸可以显著下调大鼠肺系数。六神丸可显著改善肺组织中充血、水肿、渗出等炎性病变，支气管平滑肌增厚程度减轻，炎细胞浸润情况出现减轻。

RPI的发生与多种因素相关，如自由基损伤学说[10]、肺泡Ⅱ型细胞损伤学说[11]、细胞因子学说[12]。现有学者研究发现，RP的发生机制与Th17/Treg细胞平衡、Notch信号通路相关[13-14]。IL-1β是一种炎性活细胞素，可以刺激各种免疫细胞和炎性细胞，促进炎性蛋白及递质的释放，当炎性反应发生时，其数量急剧增加，对巨噬细胞、淋巴细胞等具有趋化作用，可增强其炎性反应[15]。同样，TNF-α亦是一种促炎性因子，由巨噬细胞、单核细胞等产生，其与IL-1互相影响，在IL-1和脂多糖的作用下，可以大量释放TNF-α[16]。此外，TNF-α可以影响氧自由基（ROS）的产生和溶酶体破裂，造成细胞死亡或崩解和组织损伤。放射性的损伤引起了肺部水肿、渗出等炎性反应，并激活单核-巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性递质，使炎性递质水平增高[17]。本研究发现，六神丸可下调大鼠血清中IL-1β、TNF-α炎性反应因子。研究表明，六神丸可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能与抗肿瘤炎性微环境相关。六神丸对于减轻放射性炎性反应损伤有一定的作用，但其作用强度不如激素作用更强，随着实验研究的不断深入，六神丸抗RP炎性反应损伤作用的机制亦会更加明确。下一步可采用六神丸与激素联合用药，观察六神丸辅助西医治疗RP的优势。本研究为中医传统方剂，增加新的临床应用、减轻其在RPI方向提供研究思路。

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（2018-09-27收稿 責任编辑：王明）