金诃含片抗PM 2.5作用研究

张义智 邵成雷 王振 姬涛 侯晓群

[摘要]斑马鱼注射给予纳米活性炭，建立斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道功能评价模型。结果显示：金诃含片浓度为56、167和500ug/mL时，纳米活性炭分泌发生率分别为10.0%、20.0%和23.3%，与模型对照组（10.0%）比较P均>0.05，提示金诃含片在56、167和500ug/mL浓度时对斑马鱼分泌纳米活性炭进入肠道有促进趋势，但在统计学上无显著性差异。

[中图分类号]R285.5[文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）22-0007-02

1金诃含片和金嗓子喉片的最大耐受浓度（MTC）测定

观察测定金诃含片和金嗓子喉片对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC），以确定后续的功能性实验评价采用给药浓度。

1.1受试动物 黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，由杭州环特生物科技股份有限公司培育，共390尾。实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。

1.2受试药物 金诃含片，棕色粉末，于2017年09月11日收样，由金河藏药（山东）健康产业有限公司提供，常温阴凉避光保存。临用前用超纯水配制成浓度为50mg/mL的母液，-20℃保存。临用时用养鱼水按需稀释。

1.3仪器与试剂 解剖显微镜（型号SZX7，OLYMPUS，日本）;精密电子天平（型号CP214，奥豪斯）;六孔板（型号Fisher Scientific，中国）。

1.4浓度组别 实验1组正常对照组，实验2组金诃含片125ug/mL，实验3组金诃含片250ug/mL，实验4组金诃含片500ug/mL，实验5组金诃含片1000ug/mL，实验6组金诃含片1500ug/mL，实验7组金诃含片2000ug/mL。

1.5实验方法 选取受精后2天黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼390尾，分成正常对照组，药物组（金诃含片组，金嗓子喉片组）。药物组分别水溶给予金诃含片和金嗓子喉片125、250、500、1000、1500和2000ug/mL浓度，正常對照组采用养鱼用水正常饲养斑马鱼，每孔斑马鱼30尾，每孔3mL，确保每天更换药液，处理5天，处理结束后，观察记录斑马鱼的死亡情况，统计各组斑马鱼死亡数量以及毒性情况，确定药物组最大耐受浓度。

1.6实验结果金诃含片在125、250和500ug/mL浓度下，斑马鱼均未出现死亡，也未见任何异常表型;在1000、1500和2000ug/mL浓度下，斑马鱼均出现死亡，死亡率分别为6.7%、16.7%和66.7%。根据实验结果，确定金诃含片对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为500ug/mL。

金嗓子喉片在125至2000ug/mL浓度下，斑马鱼均未出现死亡，也未见任何异常表型。根据本实验的SOP规定（供试品的检测浓度范围，上限为2000ug/mL或最大溶解度）和本实验结果，确定金嗓子喉片对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）大于2000ug/mL。

1.7实验结论在本实验浓度条件下，山东金诃药物研究开发有限公司于2017年09月11日提供的金诃含片对斑马鱼的最大耐受浓度为500ug/mL，金嗓子喉片对斑马鱼的最大耐受浓度大于2000ug/mL。

2 金诃含片对PM2.5分泌促进作用的评价

2.1实验目的观察评价金诃含片对斑马鱼体内PM2.5分泌的促进作用，为金诃含片在抗PM2.5领域开发提供参考。

2.2受试动物黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，由杭州环特生物科技股份有限公司培育，共240尾。实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。用于金诃含片对PM2.5分泌的促进作用实验。

2.3受试药物金诃含片，棕色粉末，于2017年09月11日收样，由山东金诃药物研究开发有限公司提供，常温阴凉避光保存。临用前用超纯水配制成浓度为50mg/mL的母液，-20℃保存。临用时用养鱼水按需稀释。

2.4仪器与试剂甲基纤维素（型号Sigma，中国）;解剖显微镜（型号SZX7，OLYMPUS，日本）;精密电子天平（型号CP214，奥豪斯）;六孔板（型号Fisher Scientific，中国）;显微注射仪（型号IM-300，Narishige）;拉针仪（型号PC-10，Narishige，日本）。

2.5浓度组别实验1组正常对照组，实验2组模型对照组，实验3组金诃含片56gg/mL，实验4组金诃含片167ug/mL，实验5组金诃含片500ug/mL，实验6组金嗓子喉片222ug/mL，实验7组金嗓子喉片667ug/mL，实验8组金嗓子喉片2000ug/mL。

2.6浓度确定依据 根据金诃含片（对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为500ug/mL）和金嗓子喉片（对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）大于2000ug/mu对斑马鱼的最大耐受浓度：金诃含片对PM2.5分泌的促进作用评价实验浓度设计为56ug/mL（1/9MTC）、167ug/mL（1/3MTC）和500ug/mL（MTC）;金嗓子喉片对PM2.5分泌的促进作用评价实验浓度设计为222ug/mL（1/9MTC）、667ug/mL（1/3MTC）和2000ug/mL（MTC）。

2.7模型制作以纳米活性炭作为PM2.5来源，将纳米活性炭（浓度2.3mg/mL）注射到斑马鱼卵黄囊中剂量：69ng/尾，造模。

2.8实验方法选取斑马鱼240尾，分成正常对照组，药物组（金诃含片组，金嗓子喉片组）。将纳米活性炭注射到斑马鱼卵黄囊中建立斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道功能评价模型。模型斑马鱼分别水溶给予金诃含片56、167、500ug/mL浓度和金嗓子喉片222、667、2000ug/mL浓度，每孔斑马鱼30尾，每孔3mL，确保每天更换药液。金诃含片和金嗓子喉片处理5天结束后，分别统计斑马鱼发生体内纳米活性炭分泌进入肠道的总数量（Z），通过与模型对照组比较（卡方检验），评价金诃含片对纳米活性炭分泌进入肠道功能的影响。纳米活性炭分泌发生率计算公式如下。

进行统计学分析，采用方差分析和Dunnett's±-检验的方法，以P<0.05作为具有显著性差异评价指标。

2.9实验结果金诃含片浓度为56、167和500ug/mL时，纳米活性炭分泌发生率分别为10.0%、20.0%和23.3%，与模型对照组（10.0%）比较P均>0.05，提示金诃含片在56、167和500ug/mL浓度时对斑马鱼分泌纳米活性炭进入肠道有促进趋势，但在统计学上无显著性差异。

2.10实验结论在本实验浓度条件下，金诃含片和金嗓子喉片有促进斑马鱼分泌纳米活性炭进入肠道的趋势。

4讨论

斑马鱼（Danio rerio）是一种简单的生物实验动物，具有和哺乳动物相似的生物结构和生理功能。几乎透明的胚胎、胚胎的体外发育以及与人类高达87%的基因相似性，使得斑马鱼被广泛用于药学领域的研究。模式动物斑马鱼在生态毒理学、发育遗传学等研究领域已得到广泛应用。近年来，斑马鱼模型已拓展延伸至人类疾病动物模型、药物体内代谢及创新药物筛选研发等诸多方面。国内最新外文献表明，斑马鱼模型在推动疾病动物模型、药物活性筛选及代谢研究方向的研究取得了很大进展。本实验首次将斑马鱼模型用于评价抗雾霾作用，为其拓展应用提供参考。