兽医实验室荧光RT-PCR质量控制

摘要：近年，随着实验室荧光RT-PCR检测方法的推广应用，很多基层地区的兽医实验室和检测机构并不能控制整体的检测质量，影响最终的检测结果。该文主要结合实际工作经验，重点分析兽医实验室荧光RT-PCR检测的质量控制措施，希望通过该次研究对提高病原微生物实验室诊断准确性、精确性有一定帮助。

关键词：兽医实验室;荧光RT-PCR检测法;质量控制措施

中图分类号：S851.7 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.16.043

0 引言

兽医实验室荧光RT-PCR又被称为反转路聚合酶链反应，该种检测技术主要是将RNA的反转录技术和cDNA的聚合酶链式扩增技术有效结合，具有检测精确度高、特异性强、重复性好的特点，已被广泛应用于多种病毒的实验室诊断。荧光RT-PCR检测是一项技术要求很高的工作，在操作中，极微量的污染物污染药品都会导致假阳性假阴性的产生，最终影响检测结果。实验室布局不合理、人员培训不到位、实验室质量管理意识薄弱等问题也会影响检测结果。因此，需要加强管理，降低各种影响因素。

1 实验室人员管理

荧光RT-PCR检测法是一种成熟的病原微生物检测方法，被广泛应用于多种病毒的实验室诊断。在具体操作中，实验室人员的熟练程度和责任心直接影响检测结果的准确性。由于该种检测技术的灵敏度很高，在操作中一定要保证细致化，避免因为不细致的操作导致反应体系比例不一致，甚至造成病料交叉污染。在工作开展中，对于检测中出现的问题，要求检测人员从自身寻找原因。实验室内部应该实行考核上岗和定期培训制度，只有获得相应考核资格证书的人员，才能进入实验室开展检测。在操作中，检验人员要严格按照相关质量规程体系，分步骤操作，明确最佳的检测方法，注重实验中的每一个细节质量控制。实验室应该定期对相应的技术人员进行质量考核，组织同级别的或更高级别的实验室开展对比实验，以此提升实验室检测人员的专业能力和责任心。

2 仪器设备管理

荧光RT-PCR检测法应用中通常会涉及多种仪器和药品，常用仪器主要包括荧光RT-PCR扩增仪、生物安全柜、离心管、离心机、核算提取仪、移液器等，针对这些仪器设备，在操作中一定要严格按照相关规程，定期的维护和检查。必要时还应该对相应的称量仪器设备进行校对，保证其称量的准确性。对于检测中使用频率较高的荧光RT-PCR扩增仪，应该在制造厂商的配合下，每半年校对1次，并做好校对仪器设备的标志工作[1]。核酸产物在上机前，应该做好封膜处理，避免内容物反应或者蒸发液泄漏污染仪器。

3 药品器材管理

检测工作开展中，各项药品和试剂的质量直接影响最终的检测结果，因此在各项试剂和药品购买中，必须保证购进途径的官方统一，避免选择假冒伪劣或过期的试剂。器械设备在使用前，都需要进行严格的清洗和卫生消毒，一次性设备在使用后应该进行严格的无害化处理。实验室配置好的试剂，应该使用无菌的容器分装，或者在使用前对容器进行高压灭菌处理。此外，PCR试剂反应液应该与样品以及PCR产物分开保存，不能将其放置在同一个保存容器中，需要低温保存，经常使用的试剂，可以分装储存，避免反复融冻影响试剂质量。在实验室内部应该配置专用的工作服装、工作鞋帽和办公用品。为保障不同功能区域的清洁卫生，个体的防护设备和用品不能混合使用，需要构建物品使用管理制度。

4 检测质量控制

荧光RT-PCR检测工作开展中，要求动物实验室构建完善的技术标准和操作规程，并明确检测中的注意事项，要求检验人员严格按照操作规程的要求和相关规定内容，准确采样，准确称量，准确制样，妥善保存核酸提取物，然后开展扩增操作、产物检测。实验室内部的检测方法应该按照国际标准、国家标准、区域标准、行业标准的方式选择。需要实验室自制标准时，要进行严格的检测检验，确保合格后才能使用。此外，在检测中所采用的各种方法都应该受到质量管理控制。

5 环境管理

5.1功能划分

在实验室的内部应该将其划分为试剂储存区域、准备区域、样品处理区域、基因扩增区域和产物分析区域。如果实验室内置配置荧光PCR仪，则扩增区域和产物分析区域可以合并。各个功能区域间应该按照上述顺序进行妥善的划分，并保证整个操作单向流动，形成一个单向的保护屏障，避免不同区域之间的实验产生相互干扰，造成样品污染，影响最终的检测结果。

5.2室内环境控制

在整个实验前后，需要使用紫外线灯对整个实验区域进行严格的照射消毒，每次照射消毒时间不得低于30min，能有效破坏残留在检测环境中的RNA。紫外线消毒结束后，选择使用10%次氯酸钠溶液或1%过氧乙酸溶液，对整个地面和工作台面进行严格的清洗和卫生消毒。实验室内的样本和扩增产物是气溶胶的主要污染源，因此要保证实验室经常性的换气消毒。实验结束后所使用的一次性设备，应该严格的无害化处理，各种废弃的反应试管和枪头应该放置于1mo1/L稀盐酸中浸泡处理[2]，泡时间不能低于6h。各种废弃物必须进行高压灭菌处理，按照医疗垃圾进行无害化处理，防止对周围环境造成污染。

6 检测过程质量控制

6.1核酸提取

荧光RT-PCR检测工作开展中，RNA的提取质量直接决定着检测结果的正确性和灵敏度。在实验操作中一定要严格按照试剂盒的相关要求，在二级生物安全柜内操作，每一步骤应该认真仔细，避免各项试剂被污染，避免样本之间相互交叉污染。在开关EP管时，要注意手的任何部位都不能触及试管口和内部。样品添加时应该进行阴性对照添加，首先加样，然后再添加低浓度的样品，最后添加阳性对照。不能手动混匀样品或者使用移液器混合样品，要使用指定的仪器震荡混合。

6.2扩增

在扩增操作中，检测人员必须按照仪器设备的使用规程進行上机操作，保障各个试管平衡摆放。对于PCR管加盖平盖或者光膜时，不能用手直接触碰，更不能使用记号笔标记[3]。通常大多数仪器设备都会自动扣除本底给出扩增曲线，对于个别因为各种原因导致的失真，在判定中应该将其排除。

7 结束语

RT-PCR检测方法对技术人员的要求较高，任何一个细小的疏忽都有可能造成假阳性和假阴性，导致检测结果不能反映真实的病毒感染情况，因此在实验室诊断中，特殊检测人员在检测中不断加强自身专业素质提升，在操作中认真细致，严格按照实验室的操作规程开展实验，保证检测结果的准确性、精确性。

参考文献

[1]刘贺.荧光RT-PCR准确性的影响因素及控制策略[J].中国动物检疫，2013，30（11）：26-28.

[2]刘贺.兽医实验室RT-PCR的质量控制[J].动物医学进展，2013，34（10）：115-117.

[3]兰玲，王涛.荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测技术的比较[J].新疆畜牧业，2012（3）：34-35.

作者简介：黄美芝（1983-），女，壮族，兽医师，本科，主要从事实验室检测方面的工作。