超高效液相色谱法测定苹果汁饮料中的展青霉素及其不确定度分析

房志杰 王珏

摘要  为了在测量数据的处理、测定结果的表达和测量结果质量评定等方面与国际接轨，根据测量不确定度评定和表示（GB/T 27418-2017），食品安全国家标准 食品中展青霉素的测定（GB 5009.185-2016）中第二法高效液相色谱法测定展青霉素含量的不确定度的测定和评定，分析了使用外标法单点定标测定样品的不确定度计算方法和步骤，建立了高效液相色谱法测定方法的评定方式。通过对测量结果的不确定度评定，了解了测定过程中不确定度的主要来源，从而对在检测过程中易产生不确定度的环节加以重视，确保检验结果的可靠性。

关键词 超高效液相色谱;展青霉素;苹果汁饮料;不确定度

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2019）02-008-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.02.004

Abstract In order to be in line with international standards in the processing of measurement data， the expression of measurement results and the quality evaluation of measurement results， the uncertainty of determination of paeonillin in food safety national standard GB 5009.185-2016 by second?method high performance liquid chromatography was determined and evaluated according to the evaluation and expression of measurement uncertainty （GB/T 27418-2017）. The uncertainty of determination of paeonillin in food safety national standard GB 5009.185-2016 was analyzed. The methods and steps of calculating the uncertainty of single⁃point calibration of samples by external standard method were used to establish the evaluation method of high performance liquid chromatography method. By evaluating the uncertainty of measurement results， the main sources of uncertainty in the determination process were understood， and the links that easily produce uncertainty in the detection process were paid attention to， so as to ensure the reliability of the test results.

Key words   Ultra High Performance Liquid Chromatography;Penicillin;Apple Juice Beverage; Uncertainty

测量不确定度在检测、校准和合格评定中具有重要作用。中国实验室国家认可委员会（CNAL）要求经CNAL认可的检测实验室必须建立测定不确定度的评定程序，并有能力对每项数值要求的测量结果进行不确定评定 。食品检验工作是从最基本的称量到通过各种复杂理化方法，最终确定某种成分含量的测量过程。测量结果会受到诸多因素的影响和限制，如仪器精度、人员技术熟练水平、操作条件等。为了客观评价测量结果的可靠性，引入了“测量不确定度”这一概念。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品为市场随机抽查的苹果汁饮料。

展青霉素标准品纯度≥99.5%，1 mg;乙腈、冰乙酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters UPLC 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）;MycoSep228净化柱，氮气吹干;测定的环境条件：温度（20±5）℃，相对湿度≤75%。

1.3 样品处理

参照GB 5009.185-2016 食品安全国家标准 食品中展青霉素的测定中第二法高效液相色谱法进行。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流动相：乙腈+水（10∶90，体积比）;检测波长：276 nm;流速：0.8 ml/min;柱温：35℃，进样量：10 μl。

2 结果与分析

2.1 数学模型

X=

式中，X为试样中展青霉素的残留量（ng/g）;A为样液中展青霉素的色谱峰面积;cs为标准工作液中展青霉素的浓度（ng/ml）;V为样液最终定容体积（ml）;AS为标准工作液中展青霉素的色谱峰面积;m为最终样液所代表的试样量（g）。

2.2 不确定度的来源分析

从测定过程和确定的数学模型分析，展青霉素含量测定的不确定度主要来源于：标准物质U（S）、标准溶液重复进样Urel（AS）、样品峰面积的测定Urell（A）、样品称量Urel（m）、定容体积Urel（V）、样品处理操作过程Urel（P）的差异等几个方面。

2.3 不确定度计算公式

Urel（X）=[U（cs）/cs]2+[U（A）/A]2+[U（V）/V]2+[U（m）/m]2+[U（As）/As]2

即：UC2（X）rel=UC2（cs）rel+UC2（A）rel+UC2（V）rel+UC2（m）rel+UC2（As）rel

2.4 不确定度的评定

2.4.1 标准物质的不确定度 标准物质不确定度包含标准物质、标准储备液和标准工作液配制过程引入的不确定度。

（1）标准物质引入的不确定度评定。根据标准物质证书提供的信息，展青霉素胺的不确定度为±0.5%，按正态分布考虑，包含因子k=3，属B类评定，则有相对标准不确定度为：

U标物=0.5%/3=1.67×10-4。

（2）标准储备液配制过程引入的不确定度评定。标准物质有仅1 mg，用5 ml（V1）分度吸量管（A级）取乙酸乙酯溶解，其溶液为200 μg/ml。再用2 ml（V2）分度吸量管（A级）取200 μg/ml溶液吹干用乙酸水溶液定容至100 ml，浓度为4 μg/ml。最后用1 ml（V3）分度吸量管（A级）取4 μg/ml溶液吹干用乙酸水溶液定容至100 ml，浓度为40 ng/ml。

该过程使用的玻璃量具，按照JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》的要求，均有相应的最大容量允差，按矩形分布考虑，k=。标准储备液不确定度来源为：5 ml（V1）分度吸量管（A级）

由5 ml A级单标移液管引起的不确定度[U（V1）]：

①校准。A级5 ml单标移液管的容量允许误差为±0.02 ml，取k=，则U（V11）=0.02/=0.012 ml;

②重复性。A级5 ml单标移液管读数重复性为±0.01 ml，取k=，则U（V12）=0.01/=0.006 ml;

③ 温度。实验室的温度波动范围一般为±5℃，20℃玻璃膨胀系数为2.5×10-5/℃，乙酸乙酯体积膨胀系数为1.39×10-3/℃，容量瓶校准温度与使用温度不同引起的体积不确定值：

ΔV=V1-V2=（α-α玻璃）×V×ΔT=（1.39×10-3-2.5×10-5）×100×5=0.682 5（ml）

按照矩形分布换算成标准偏差为：

ΔV/k=0.682 5/=0.393 9（ ml）

Urel（t）=0.393 9 ml/5 ml=0.078 78

以上3项合成得出Urel（V）==0.079 87

因此，标准储备液配制过程的相对不确定度：

Urel（储备液）==0.079 87

（3）标准工作液配制过程产生的不确定度评定。标准工作液是由三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的质量浓度分别为40 ng/ml。标准工作液制备过程使用了一系列玻璃量具，按照JJG 196-2006的要求，均有相应的最大允差，按照矩形分布考虑，k=，相对不确定度分量见表1 。

因此，标准工作液配制产生的不確定度：Urel标曲==0.006 2

由上述不确定度分量，得到展青霉素标准物质的相对标准不确定度：Urell（S）==0.080 11。

2.5 由重复进样引起的不确定度U（As）与U（A）

由仪器给出标准溶液和样品峰面积标准偏差为U（As）与U（A），是随机测量，属A类不确定度。

2.5.1 标液溶液重复进样5次测定峰面积 分别为：43 125、43 598、42 999、43 189、43 345，平均值AS=43 251。

标液溶液峰面积的标准不确定度按贝塞尔公式计算：

U（As）==103

Urel（As）=U（As）/As=0.002 4;

2.5.2 样品溶液重复进样5次测定峰面积 分别为：33 221、33 602、32 621、33 344、33 541，平均值A=33 266。

U（A）==175

Urel（A）=U（A）/A=0.005 3

2.6 仪器数据处理系统引入的不确定度

根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%～1.0%，取1.0%，按均匀分布考虑，B 类评定，峰面积的相对不确定度分量U1=1%/3= 5.77×10-3。

液相色谱仪测定用微量进样器进样（不确定度1%），按均匀分布考虑，B 类评定，则此项相对不确定度分量U2=1%/3=5.77×10-3。

仪器数据处理系统引入的不确定度：U仪==0.008 2

由此，得到样品峰面积测量的不确定度评定：U/rel（A）==0.009 8

得到标液峰面积测量的不确定度评定：U/rel （AS）==0.008 5

2.7 称样量的不确定度评定

根据称量使用的电子天平检定证书，其最大允许误差±0.01 mg，其置信水平99%，按正态分布考虑，包含因子k=3，则标准不确定度为U（m）=0.01 mg/3= 0.003 33 mg。

样品称样量为4.00 g，则其相对标准不确定度为：Urel（m）=0.003 33 mg/4.00 g =8.25×10-4。

2.8 样品处理液定容体积的不确定度评定

样品经称提取、净化预处理后，氮气吹干，残留物用1 ml 流动相定容。

2.8.1 定容体积的相对标准不确定度定容采用1 ml 单标线吸量管（A级），按照检定规程JJG 196-2006要求，其最大容量允许误差为±0.00 7 ml，即相对允许误差为±0.7%，按矩形分布考虑，B 类评定，则定容体积的相对标准不确定度为Urel（V）=0.7%/3=0. 004 04。

2.8.2  1 ml单标线吸量管校准温度与使用温度不同引起的体积不确定度

ΔV=V1-V2=（α水-α玻璃）×V×ΔT=1.8×10-4×1×5=9.0×10-4（ml）

按照均匀分布换算成标准偏差为：

ΔV/k=9.0×10-4/=5.2×10-4（ml）

Urel（Vt）=5.2×10-4 ml/1 ml=0. 000 52

由以上2项合成得出Urel（V）==0.004 07

2.9 加标回收率的不确定度

因样品前处理不完全或处理过程中展青霉素的损失，通过添加三聚氰胺（质量浓度50 μg/L）计算加标回收率。实验结果得到，该法加标回收率为96.5%～101.1%。加标回收率的不确定度按JJF 1059-1999的规定，得到：U2R=。

式中，b+=（101.1-100）%=1.1%，b-=（100-96.5）%=3.5%。

加標回收率的标准不确定度为：UR==0.013 28

所以，前处理过程引起的相对不确定度为：Uel（P）==0.013 46

2.10 重复性测量的不确定度

该不确定度属A类评定，采用同一样品进行重复实验进行评估，步骤覆盖实验方法的全过程。

测量重复性的标准不确定度为：Ux==0.057

通过表3计算可得试样中展青霉素含量的最佳估计值为X=25.4 μg/kg，则测量重复性的相对不确定度为：Urel X=Ux/X=0.057/25.4=0.002 2

2.11 相对标准不确定度各分量汇总

2.12 合成标准不确定度评定

由表4中各相对不确定度合成：

Urel（X）==0.082

2.13 扩展不确定度评定

扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信水平95%，则k=2。试样中展青霉素含量测定的相对扩展不确定度U=Urel（X）×k=0.164。试样中展青霉素含量的最佳估计值（X）=25.4 μg/kg，其扩展不确定度U=25.4 μg/kg ×0.164=4.17 μg/kg。

3 结论

高效液相色谱法测定展青霉素含量，当取样量为4.0 g，k=2（95% 置信度），测量苹果汁中展青霉素的含量为（25.4 ±4.17） μg/kg。

参考文献

[1] JJG 196-2006，常用玻璃量器检定规程[S].2006-12-08.

[2] GB/T 27418-2017，测量不确定度评定和表示[S].2017-12-29.

[3] GB 5009.185-2016，食品安全国家标准 食品中展青霉素的测定[S].2016-12-23.

[4] JJF 1059-1999，测量不确定度评定与表示[S]. 1999-01-11.

责任编辑：刘赟