水体铜污染对苦草生长及叶绿素荧光特性的影响

高桂青 王香莲 卢龙 等

摘 要：该文以苦草（Vallisneria natans）为材料，研究了不同浓度铜污染水体对其叶/根长、生物量、光合色素含量、体内重金属含量及叶绿素荧光参数的影响。结果表明：随着水体铜浓度的增加，苦草的叶长、根长、生物量均显著下降;光合色素含量逐渐下降，其中叶绿素a比叶绿素b下降明显，类胡萝卜素下降幅度最小;叶片铜含量随铜浓度的增加显著上升（P<0.05），各处理组根铜含量没有显著性差异，在水中铜低于0.5 mg·L-1的环境中苦草具有正常的光合活性。除0.5 mg·L-1处理组外，最大荧光（Fm）、最大光化学效率（Fv/Fm）、潜在光化学效率（Fv/Fo）、光化学淬灭系数（qP）与有效量子产量[Y（Ⅱ）]均比对照组显著降低（P<0.05），而非光化学淬灭效率（qN）、调节性能量耗散的量子产量[Y（NPQ）]、非调节性能量耗散的量子产量[Y（NO）]均呈上升趋势，其中Fv/Fo对铜污染反应最为灵敏。综合各参数变化情况，随着水体铜浓度的增加，苦草生长受到抑制，叶片利用光能的效率下降，PSⅡ反应中心的电子传递受到明显的抑制;苦草通过自身调节以热的形式将过剩光能耗散，以减轻PSⅡ反应中心受伤害的程度;苦草是铜超富集植物，其可作为低浓度铜污染水体生态修复的备选物种。

关键词：苦草，铜污染，生物量，光合色素，荧光特性

Abstract：Vallisneria natans was selected as test materials and cultured in different concentrations of Cu polluted water. The lengths of leaves and roots，biomass，photosynthetic pigment，heavy metal content and chlorophyll fluorescence parameters of V. natans were observed. The results showed that the lengths of leaves and roots，biomass of V. natans were significantly decreased with the increase of Cu concentration. The leaves gradually lost chlorosis，the chlorophyll a decreased more than the chlorophyll b，and carotenoids had the smallest decline. Cu content in the leaves of V. natans increased significantly（P<0.05） with the increase of Cu concentration，and there was no significant difference in Cu content of roots between treatment groups. V. natans has normal photosynthetic activity when Cu was less than 0.5 mg·L-1 in water. Except for the 0.5 mg·L-1 treatment group，Fm， Fv/Fm，Fv/Fo，qP and Y（Ⅱ） were significantly lower than the control group （P<0.05），while qN，Y（NPQ） and Y（NO） showed an upward trend，in which Fv/Fo was the most sensitive to Cu pollution. In summary，the growth of V. natans was inhibited with the increase of Cu concentration，the efficiency of utilizing light energy of leaves was decreased，and the electron transfer of PS Ⅱ reaction center was obviously inhibited. V. natans consumed excess light energy in the form of heat through self-regulation，to reduce the extent of damage to PS Ⅱ reaction center. V. natans was a Cu hyperaccumulator which can be used an alternative species for ecological restoration of low-Cu-polluted water.

Key words：Vallisneria natans，Cu pollution，biomass，photosynthetic pigment，fluorescence characteristics

近年來，由于矿产开发及工业废水的滥排滥放，水体中的重金属污染问题日益突出（Ji et al.，2018）。重金属不能自然降解或被微生物所分解，而是通过食物链的生物放大作用富集生物体并损害动物和人类健康（徐勤松等，2003）。铜（Cu）是植物生长的必需微量元素（Fernandes & Henriques，1991），在许多和细胞代谢相关的酶和光合作用中起着不可替代的作用（Nagajyotic et al.，2010）。但过量Cu会对植物造成极大的毒性（Shahid et al.，2016），抑制光合作用的进行，降低酶的活性等。沉水植物作为水生态系统中的重要初级生产力，对于维持水生态系统的生物多样性、生物地球化学循环和清水稳态具有重要作用（宋玉芝等，2011）。许多沉水植物能够富集水体和底泥中的Cu（潘义宏等，2010;Xue et al.，2010;谢佩君等，2016），且不同类型的沉水植物对Cu具有不同的耐受性和富集能力（Upadhyay et al.，2014;Wang et al.，2014;简敏菲等，2016）。目前国内外学者一直关注重金属胁迫下沉水植物体内重金属的积累（梁珊等，2016;Ahmad et al.，2016）、生理生化的影响（徐勤松等，2006;Wang et al.，2012）、亚显微结构变化（计汪栋等，2007;赵秀侠等，2017）等，对于重金属胁迫下苦草等沉水植物的光合荧光特性较缺乏研究。

1980年Schreiber教授发明脉冲振幅调制叶绿素荧光仪，在探测逆境对植物光合作用的影响等方面具有快速、简便、灵敏、可靠等特性。基于光合作用理论，叶绿素荧光技术不会破坏细胞，不会对植物造成伤害，被认为是研究植物光合作用与环境胁迫之间关系的有效探针（李伶等，2010;晋利和李晓亮，2015）。水下调制荧光仪（Diving-pam）可以原位测定沉水植物的光合作用（Yu et al.，2010;Hussner et al.，2011）。

苦草（Vallisneria natans）为水鳖科苦草属多年生沉水草本植物，具有较高的经济利用价值（王艳丽等，2006），再生能力强，广泛应用于水体生态修复工程（顾燕飞等，2017;Wang et al.，2009），对重金属具有较强的吸收积累能力（Wang et al.，2012;Xing et al.，2013）。本研究通过不同浓度铜污染水体对苦草叶长、根长、生物量、光合色素含量及叶绿素荧光参数的影响，探讨苦草受胁迫后的生长状态和光合系统响应的内在机制，以期为铜污染水体的生态修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以苦草为材料，于2017年6月初采自鄱阳湖南矶山自然保护区。将采集到的苦草去除死叶和死根，选择长势一致的植株，修剪为叶片长度为15 cm，根长为3 cm，轻轻洗去叶表面附着物和根部泥土。

1.2 试验设计

试验在南昌工程学院生态园内完成。将从鄱阳湖采集到的底泥铺于塑料方盒（长34.0 cm、宽22.5 cm、高10 cm），底泥厚8 cm，每盒均匀种植苦草12株，然后将塑料方盒放入玻璃缸（长40 cm、宽40 cm、高50 cm）内，向缸中加入经过晾晒的自来水至40 cm高度。预培养1周后，加入不同浓度的CuSO4溶液进行处理，结合前期预处理，5种处理分别设置为0 mg·L-1对照组，0.5 mg·L-1处理组，1.0 mg·L-1处理组，1.5 mg·L-1处理组和2.0 mg·L-1处理组，每个处理设置3个重复。在胁迫处理1周后，测定各参数。

1.3 测定指标及方法

采用水下调制荧光仪（Diving-pam）和数据采集软件Wincontrol原位测定苦草叶片的叶绿素荧光参数。每一处理组随机取3株，用暗叶夹夹住叶片（离顶端3 cm左右），经暗适应20 min 后，打开叶夹，开启检测光，得到最小荧光（Fo），最大荧光（Fm）。PSⅡ反应中心的最大光化学效率（Fv/Fm）、潜在光化学效率（Fv/Fo）、光化学淬灭系数（qP）、非光化学淬滅系数（qN）、有效量子产量[Y（Ⅱ）]、调节性能量耗散的量子产量[Y（NPQ）]和非调节性能量耗散的量子产量[Y（NO）]由系统选定模式自动生成。

将采集的苦草用自来水将表面附着物和泥清洗干净，用直尺测量其叶片和根的最大长度，用天平称量鲜重，于空气中自然风干后称其干重;采用丙酮萃取法测定光合色素含量（李合生，2010）;将叶片和根于烘箱中烘至恒重，用粉碎机研磨后过100目筛，采用三酸消化法（HNO3 -HF-HClO4），定容后用ICP-AES测定铜含量。

1.4 数据处理与分析

试验结果为3次试验的平均值±标准差，试验原始数据的处理和制图釆用Excel 2017软件;用SPSS19.0软件对不同浓度铜污染下反应数据进行单因素方差分析，用Duncan法进行多重比较分析，P<0.05表示差异显著;并进行铜浓度与荧光参数的Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 铜污染对苦草生长的影响

根据试验所设置的5个不同浓度梯度，测定苦草的叶长、根长和生物量，分别统计其变化特征及相关显著性，结果如图1所示。铜明显抑制了苦草的生长，叶长、根长、鲜重和干重均显著低于对照组。2.0 mg·L-1处理组苦草叶和根的长度最低，分别为对照组的82.47%和61.10%。0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1处理组根的鲜重无显著性差异。2.0 mg·L-1处理组苦草叶和根的鲜重最低，分别为对照组的67.73%和53.37%;干重分别为对照组的71.31%和53.37%。

2.2 铜污染对苦草叶片光合色素的影响

随着水体铜浓度的升高，苦草叶片的叶绿素总量（Ct）、叶绿素a（Ca）、叶绿素b（Cb）、类胡萝卜素（Cc）和叶绿素a/叶绿素b（Ca/Cb）变化趋势一致，整体均成下降趋势，叶片逐渐褪绿。Ct和Ca下降显著（P<0.05），对照组和0.5 mg·L-1处理组的Cb差异不显著（P>0.05）。叶绿素a比叶绿素b下降幅度大，其对铜胁迫更为敏感。Cc下降幅度较小，类胡萝卜素/叶绿素总量（Cc/Ct）先降低后增加，说明Cc对胁迫不敏感。Ct、Ca、Cb、Cc、Ca/Cb与铜浓度的相关系数r分别为-0.970**，-0.969**，-0.952**，-0.864**，-0.870**，均呈极显著负相关。

2.3 铜在苦草体内的富集

苦草叶片中铜的富集量随着水体铜浓度的增加而增加，处理组与对照组之间存在显著性差异（P<0.05）。2.0 mg·L-1处理组叶片铜含量达到（5.74±1.07）mg·g-1，约为0.5 mg·L-1处理组的3.037倍;根中铜含量在各处理组间无显著性差异（P>0.05）。

2.4 铜对苦草叶片叶绿素荧光参数的影响

根据实验所设置的5个不同浓度梯度，测定苦草叶片的Fo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、qP、qN、Y（Ⅱ）、Y（NO）和Y（NPQ），分别统计其变化特征及相关显著性，结果如图4、图5、图6所示。

最小荧光Fo指叶片经过充分暗适应后，光系统Ⅱ的反应中心全部开放时的叶绿素荧光产量。处理组的Fo分别为对照组的1.003、1.024、1.042、1.175倍，但差异不显著。Fo与铜浓度呈显著正相关，相关系数r为0.555*。处理组的Fm均小于对照组，且随铜浓度的增加下降显著（P<0.05）。除0.5 mg·L-1处理组与对照组差异不显著，其它处理组的Fv/Fm均下降显著，2.0 mg·L-1处理组仅为对照组的46.68%。Fv/Fo变化趋势与Fv/Fm相似。当铜浓度低于0.5 mg·L-1 时，对叶片PSⅡ反应中心捕获光能的效率影响不显著。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo与铜浓度呈极显著负相关，相关系数r分别为-0.914**、-0.964**、-0.958**。

随着铜浓度的增加，qP与qN呈相反的变化趋势。qP下降显著（P<0.05），2.0 mg·L-1处理组仅为对照组的54.90%;qN呈上升趋势，2.0 mg·L-1处理组达到最大值0.608，高出对照141.3%，说明当苦草受到铜胁迫时，为维护自身生长需要，会将越来越多天线色素吸收的光能以热能形式耗散掉用于进行自我保护（刘涛等，2017;钱永强等，2011;吴昊等，2016）。qP与铜浓度呈极显著负相关，相关系数r为-0.982**;qN与铜浓度呈极显著正相关，相关系数r为0.894**。

有效量子产量Y（Ⅱ）随着铜浓度的增加，下降显著（P<0.05）。Y（Ⅱ）与铜浓度呈极显著负相关，相关系数r为-0.927**。这表明苦草叶片的实际光合效率随着铜浓度的增加而降低。随着胁迫强度的增大，Y（NO）缓慢上升，Y（NPQ）也整体成上升趋势。2.0 mg·L-1处理组Y（NO）和Y（NPQ）分别是对照组的1.66倍、4.02倍，Y（NO）和Y（NPQ）与铜浓度呈极显著正相关，相关系数r分别为0.896**、0.858**。

3 讨论

重金属胁迫对植物生长具有强烈的抑制作用，严重时会完全停止生长，出现不开花，不结果等现象（简敏菲等，2017）。本研究表明，水体铜污染对苦草生长有显著的抑制作用，2.0 mg·L-1处理组部分叶片脱落，生物量明显减小，但仍能生存。而陈萍萍等（2013）认为1.0 mg·L-1的铜对苦草生长有促进作用，这是因为其种植苦草株数比本研究大很多所致。苦草对铜的富集量较大，叶片铜含量可达到（5.74±1.07）mg·g-1，属于Cu超富集植物（Xing et al.，2013），其可以作为低浓度铜污染水体生态修复的备选物种。

重金属对植物光合作用的影响主要是通过破坏叶绿体膜和类囊体膜的超微结构，抑制叶绿素的合成，阻断PSⅡ的电子传递，以及破坏卡尔文循环的关键酶等方式来降低光合效率（Seregin & Ivanov，2001）。本研究中随着铜浓度的增加，光合色素含量显著下降，叶片逐渐褪绿，且老叶最先褪绿，这与竹叶眼子菜遭受Cu胁迫的变化规律相一致（计汪栋等，2007）。其中Ca比Cb下降更快，Ca对Cu更敏感。Ca/Cb缓慢降低，说明类囊体的垛叠程度逐渐降低，叶片的光抑制增加（郭书奎和赵可夫，2001）。随着铜浓度增加，叶绿素含量降低，主要原因可能是铜进入植物细胞内，与叶绿体蛋白上的巯基结合（Assche & Clijsters，1990）或取代其中的Fe2+、Zn2+、Mg2+（张金彪和黄维南，2007），破坏叶绿体结构;同时，随着铜在植物体内的累积，它与细胞中合成叶绿素的某些酶（原叶绿素酸酯还原酶和胆色素原脱氨酶）结合（Asgharipour et al.，2011），使酶活性受阻，叶绿素合成受到抑制。

叶绿素荧光动力学参数已被公认为植物抗逆研究的良好指标之一，在正常条件下生长的植物各荧光参数比较稳定，不会出现较大的波动（Roháek，2002）。重金属对沉水植物光合作用的影响程度可以通过测定荧光值的变化来反映（李磊和黄小平，2009）。Fo的大小与PSⅡ原始激发色素密度以及反应所处类囊体结构状态及叶绿素含量有关，而与光化学反应无关（陈正勇等，2011）。在本研究中Fo略有增加，可能是铜会激发色素密度升高和内囊体膜的改变，以适应环境变化。Fv/Fm表示当所有光系统Ⅱ反应中心處于开放态时的最大量子产量，该指标可以从量子水平反映理论上植物光合能力可以达到的最大程度，胁迫条件下该参数显著下降（许大全等，2013）。水体0.5 mg·L-1铜对苦草叶片的潜在最大光合能力影响微弱，造成的胁迫较轻。Fv/Fo常用于度量光系统Ⅱ的潜在活性，其对光合效率的变化很敏感。研究表明，铜、 镉、 铬和锌可以在水裂解端位点捕捉电子流，铜很有可能通过影响水裂解端的电子流而影响PSⅡ的活性（Mallick & Mohn，2003）。

在本研究中Fv/Fo 的变化大于其他指标，说明铜对水裂解端的影响远大于其他指标，这与李伶等（2010）对浮萍的研究结果相类似。

光化学淬灭系数（qP）是将捕获的光子能量用于光化学反应的能力指标，本研究中处理组的qP均低于对照组，说明铜抑制了苦草叶片光系统氧化侧向PSⅡ反应中心的电子流动，PSⅡ的电子传递活性变小，导致光合速率下降（邱岚等，2018），以热或其他形式耗散的光能增加。非光化学猝灭系数（qN）的升高意味着重金属限制了PSⅡ的电子传递，导致还原型辅酶Ⅱ和ATP合成的下降（Janssen et al.，1992），PSⅡ吸收的光能以潜在热形式耗散的能力增强，对苦草本身有保护作用。

PSⅡ反应中心吸收的光量子主要通过光合电子传递、叶绿素荧光及热散失三个途径进行转化与耗散（甘龙等，2017），在胁迫环境下三者的比例会发生变化。本研究中随着铜浓度的增加，Y（Ⅱ）所占比例最小，这与过量的Cd会直接抑制光合电子传递的速率，从而降低光化学途径转化能量的比例相类似（秦天才等，1994）。Y（Ⅱ）的下降必然会造成Y（NPQ）和Y（NO）的升高，且Y（NPQ）的上升幅度高于Y（NO），说明叶片中铜的积累对苦草造成了伤害，迫使其通过调节自身来抵御外界环境所带来的伤害，且胁迫强度越大，苦草的响应越大。这与重度胁迫下植物对光能的利用减弱，并以增加调节性能量耗散的量子产量的方式来消耗过多的热量来保护自身（吴昊等，2016）相稳合。

4 结论

（1）水体铜污染对苦草的生长、光合素含量有明显的抑制作用，且铜对叶绿素a的破坏作用强于叶绿素b。（2）铜会抑制苦草PSⅡ反应中心的光合活性，限制电子传递;其可通过自身调节以热的形式将过剩光能耗散，减轻PSⅡ中心受伤害的程度。（3）苦草对铜有较强的富集能力，在铜浓度低于0.5 mg·L-1的水环境中苦草具有正常的光合活性，2.0 mg·L-1超出了苦草的忍受范围，可推测将苦草用于低浓度铜污染水体的生态修复，浓度阈值尚需更多研究来进一步论证。

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