青胡桃总黄酮含量测定及抗氧化活性分析

赵国超 周欣 李容 等

摘要：【目的】对不同产地青胡桃中总黄酮含量进行测定，并对青胡桃抗氧化活性进行研究，为其作为天然抗氧化剂的开发和利用提供科学依據。【方法】通过紫外—可见分光光度法对贵州省10个县（区）的青胡桃中总黄酮含量进行测定比较;并以赫章县青胡桃为试验材料，采用DPPH法和ABTS法对青胡桃不同溶剂萃取物的抗氧化活性进行综合评价。【结果】在青胡桃总黄酮含量测定方法中，芦丁质量浓度在0.5～4.0 mg/mL内线性良好，平均回收率为97.47%，相对标准偏差（RSD）为1.26%（n=9）;不同地区青胡桃中总黄酮平均含量差异不明显，贵州省胡桃最主要产地赫章县的青胡桃总黄酮平均含量为9.51%。青胡桃的80%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物中总黄酮含量分别为286.59、89.04、108.48和173.67 mg/g，4种萃取物均有清除DPPH自由基和ABTS自由基的作用，且随萃取物质量浓度的增加而逐渐增强，抗氧化能力排序为80%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。【结论】建立的青胡桃总黄酮含量测定方法简单、快速、便捷，其线性、稳定性、精密度、重复性和回收率良好。青胡桃具有较强的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂进行开发，具有较好的功能性食品和药品开发前景。

关键词： 青胡桃;总黄酮;ABTS;DPPH;抗氧化活性

中图分类号： S664.1                  文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0357-07

Abstract：【Objective】Determination of total flavonoids in Juglans regia L. from different producing areas in Guizhou Province was conducted，and the antioxidant activities of J. regia were also studied. It would provide theory and basis for the further development and utilization of J. regia as a natural antioxidant. 【Method】Taking J. regia in ten different counties（district） of Guizhou Province as the research object，the contents of total flavonoids were determined and compared with ultraviolet-visible spectrophotometry. Then with J. regia from Hezhang County as samples，the antioxidant activities of different solvent extracts of J. regia by DPPH method and ABTS method were evaluated. 【Result】 In the method for determining the total flavonoids content of J. regia，rutin had sound linearity within the concentration range in 0.5-4.0 mg/mL， the average recovery was 97.47%， relative standard deviation（RSD） was 1.26%（n=9）.  The average content of total flavonoids in J. regia from different regions did not vary largely. The main producing area of walnut in Guizhou Province is Hezhang County. The average content of total flavonoids in J. regia in Hezhang County was 9.51%. The content of total flavonoids in 80% ethanol extract，petroleum ether extract，ethyl acetate extract and water extract of J. regia were 286.59，89.04，108.48 and 173.67 mg/g， respectively. The four extracts had the functions of scavenging DPPH free radicals and ABTS free radicals. The order of antioxidant capacity was 80% ethanol extract>water extraction>ethyl acetate extraction>petroleum ether extraction. 【Conclusion】The established method to determine the content of the total flavonoids in J. regia has the advantages suck as quick and simple，feasible，and sound linearity，precision， repeatability and recovery. J. regia has strong antioxidant activity. It can be used as a natural antioxidant and has a good prospect in functional food and drug development.

Key words： Juglans regia L.; total flavonoids; ABTS; DPPH; antioxidant activity

0 引言

【研究意義】活性氧（ROS）是一种机体正常代谢和外源性暴露的产物。细胞系统受ROS持续影响后产生氧化应激，从而诱发各种退行性病变和机体衰老（Morrissey and O’Brien，1998;Circu and Aw，2010）。因此，具有清除自由基能力的抗氧化剂受到人们高度重视，而天然抗氧化剂因其安全无公害的特点成为药品和食品科学领域的研究热点之一。胡桃中主要含有黄酮类、醌类、二芳基庚烷类、萜类、酚类、挥发油及其他化合物（Zhang et al.，2012;吴威等，2013;Salimi et al.，2014），其中黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫、抗衰老、降血脂、抗肿瘤、抗心肌缺血、抗脑缺血等多种药理作用（马锐和吴胜本，2013;谢进等，2017）。青胡桃为胡桃科植物胡桃（Juglans regia L.）的新鲜或干燥幼果，在贵州传统用药历史悠久，收载于2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，其性味苦、涩、平，主要功效有清热解毒、消肿止痛等（贵州省药品监督管理局，2013）。国内外学者对青胡桃的药理作用进行研究，证明其具有镇痛（杜旭等，2000）、心血管保护（Cortés et al.，2006;Ryan et al.，2006）、抗衰老（陈红红等，2008）、抗炎（Hosseinzadeh et al.，2011）、抗肿瘤（Alshatwi et al.，2012）、抑菌（Zmantar et al.，2016;杜慧平等，2017）、杀虫（Shang et al.，2018）等药理作用，但对于其抗氧化作用的研究较少。本课题组在前期试验中发现青胡桃具有较好的抗氧化活性，且胡桃作为贵州省的一种地标性作物，在贵州种植面积广，因此，测定青胡桃中抗氧化活性物质总黄酮的含量，对于胡桃的综合利用具有重要意义。【前人研究进展】目前国内外学者已对胡桃抗氧化进行了部分研究。吕海宁等（2011）研究核桃青皮的体外清除自由基活性时发现，不同萃取部位均具有较强的清除自由基能力，排序为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>水部位。徐红艳等（2012）对胡桃楸种仁壳黄酮的抗氧化活性进行测定，结果表明，胡桃楸种仁壳黄酮具有明显的清除ABTS、DPPH和OH自由基能力，对铁离子具有一定的鳌合作用，且抗氧化活性与黄酮含量呈剂量效应关系。Zhao等（2014）对胡桃叶中的黄酮类化合物抗氧化活性进行研究，结果表明胡桃叶中的黄酮类化合物具有抗氧化特性，且这些特性与调节免疫功能和增强抗癌活性有关。田平平等（2016）研究表明，核桃青皮具有较好的抗氧化活性，其中主要活性成分为7种多酚类活性成分，并发现环境因子对核桃青皮活性成分的抗氧化稳定性有一定影响。Figueroa等（2016）对10个不同品种胡桃的总酚含量及其生物利用度和抗氧化活性进行研究，发现不同品种胡桃的抗氧化能力不同，取决于其中总酚含量。Moghaddam等（2017）研究胡桃外果皮和内果皮各种提取物的体外抗氧化活性，发现内果皮的甲醇提取物富含酚类和黄酮类化合物，且具有显著的自由基清除活性，其抗氧化能力与合成抗氧化剂化合物（BHT）相当。【本研究切入点】虽然已有不少关于胡桃抗氧化活性的研究，但主要集中在胡桃叶、胡桃壳提取物、胡桃外表皮的相关活性等方面（徐红艳等，2012;Zhao et al.，2014;Moghaddam et al.，2017;Schwindl et al.，2017），对于青胡桃抗氧化活性与总黄酮含量间的关系研究较少，对不同产地青胡桃的总黄酮含量进行测定比较研究也鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过紫外—可见分光光度法测定青胡桃中总黄酮含量，对该方法进行方法学考察，并利用该方法对青胡桃不同溶剂萃取物中的总黄酮含量进行测定，同时应用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力法分析青胡桃不同溶剂萃取物的抗氧化活性，为发掘青胡桃作为天然抗氧化剂提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

青胡桃分别采自贵州省赫章县、云岩区、六枝特区、纳雍县、花溪区、白云区、威宁县、大方县、斗蓬山和天柱县，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为胡桃科胡桃属植物胡桃（Juglans regia L.）的幼果。DPPH（纯度≥98%，批号217-591-8）购自日本东京化成工业株式会社;ABTS（纯度≥98%，批号30931-67-0）购自北京百灵威科技有限公司;芦丁（批号R2DJ-35XP）购自中国食品药品检定研究院;6-羟基-2，5，7，8-四甲基色胺-2-羧基（Trolox）购自贵州迪大生物科技有限公司;过硫酸钾购自天津博迪化工股份有限公司;无水乙醇（分析纯）购自天津市富宇精细化工有限公司;甲醇（优级纯）、石油醚（优级纯）和乙酸乙酯（优级纯）均购自国药集团化学试剂有限公司。

主要仪器设备：Spectra Max Plus 384酶标仪（美国Molecular Device公司）;XS105十万分之一分析天平、AL204万分之一分析天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司];DFY-200高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）;R-200旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）;电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）;KQ-300DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1. 2 青胡桃不同溶剂萃取物制备

赫章县青胡桃鲜品用清水洗净后切片并阴干，粉碎过80目筛，制成青胡桃干粉。精密称取青胡桃粉末20.0 g置于5000 mL锥形瓶中，加入80%乙醇1000 mL，超声波提取80 min（300 W、40 kHz），提取2次，过滤，将滤液浓缩并冷冻干燥，得到青胡桃乙醇粗提物。将其用适量蒸馏水悬浮后倒入分液漏斗中，按体积比1∶1加入石油醚，振荡，静置2 h，分液，上层液体倒入烧杯中，得到石油醚萃取液，下层液体仍按体积比1∶1加入新的石油醚，石油醚萃取操作重复3次，合并石油醚萃取液，旋蒸浓缩，所得浸膏进行冷冻干燥得到石油醚萃取物;将石油醚萃取所得下层液体倒入分液漏斗中，采用石油醚萃取的相同技术路线制备乙酸乙酯萃取物;乙酸乙酯萃取剩余物作为水萃取物。将各部分冷冻干燥，每部分平均分成3份后备用。

1. 3 含量测定供试品溶液制备

精密称取青核桃粉末0.2 g置于25 mL锥形瓶中，加入80%乙醇10.0 mL，稱定重量，超声波提取80 min（300 W、40 kHz），再称定重量，加入80%乙醇补足减失重量，过滤，取滤液，重复2次。合并提取液，得到青胡桃供试品溶液。

1. 4 芦丁标准曲线绘制

参考傅文军等（2005）的方法，稍加修改。精密称取芦丁对照品8.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入适量80%乙醇，置于超声波清洗器中使其溶解后冷却，加80%乙醇定容并摇匀，即得到质量浓度为0.8 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0和4.0 mL对照品溶液置于10 mL具塞试管中，分别加入80%乙醇4.0 mL和5% NaNO2溶液0.7 mL，混匀后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀后放置10 min，再加入4% NaOH试液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL（李淑珍等，2015），摇匀后放置8 min，以相应试剂作空白对照，依照紫外—可见分光光度法于200～700 nm波长处扫描，对照品溶液在510 nm有较大吸收。以芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标（x）、吸光值为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到芦丁在0.5～4.0 mg/mL浓度范围内的回归方程：y=0.1979x+0.0271（R2=0.999）。

1. 5 青胡桃不同溶剂萃取物中总黄酮含量测定

分别准确称取赫章县青胡桃不同溶剂萃取物0.01 g，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇定容，制得1 mg/mL溶液，代入芦丁标准曲线中，测得各萃取物中总黄酮含量，重复3次。

1. 6 方法学考察

因贵州省胡桃主产地为赫章县，故以赫章县青胡桃为方法学考察的试验对象。

1. 6. 1 稳定性考察 将赫章县青胡桃样品按1.3方法制备样品溶液，取1.0 mL样品溶液，置于10 mL具塞试管中，加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混匀后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀后放置10 min，再加入4% NaOH试液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，摇匀后放置8 min，以相应试剂作空白对照，于510 nm处测定吸光值。每隔1 h测定1次，共测6次。

1. 6. 2 精密度考察 方法同1.6.1，分别测定5次。

1. 6. 3 重复性考察 取赫章县青胡桃样品6份，按1.3方法制备样品溶液，分别精密吸取样品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混匀后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀后放置10 min，再加入4% NaOH试液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，摇匀后放置8 min，以相应试剂作空白对照，于510 nm处测定吸光值。

1. 6. 4 回收率考察 精密称取赫章县青胡桃样品粉末0.1 g 9份，每3份1组，向3组中分别精密加入样品含量的50%、100%和150%的芦丁标准品溶液，按1.3方法制备样品溶液，分别精密吸取样品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混匀后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀后放置10.0 min，再加入4% NaOH试液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，摇匀后放置8 min，以相应试剂作空白对照，于510 nm处测定吸光值，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

1. 7 不同产地青胡桃中总黄酮含量测定

分别取不同产地青核桃粉末0.2 g，按1.3方法制备得到不同产地青胡桃供试品溶液。分别取不同产地青胡桃供试品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入80%乙醇4.0 mL和5% NaNO2溶液0.7 mL，混匀后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀后放置10 min，再加入4% NaOH试液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，摇匀后放置8 min，以相应试剂作空白对照，于510 nm处测定吸光值。进行3次重复，计算不同产地青胡桃中总黄酮的平均含量。

1. 8 抗氧化活性能力测定

1. 8. 1 DPPH自由基清除能力测定 参考Sharma和Bhat（2009）的方法，略加改动。精密称取9.86 mg DPPH，用无水甲醇定容至100.0 mL，超声波溶解，得到紫色DPPH溶液。将不同质量浓度（10～160 µg/mL）的样品和Trolox溶液分别加入配置好的DPPH溶液（体积比1∶1），室温下暗处反应0.5 h，以无水甲醇溶液作空白对照，测其在517 nm波长处的吸光值（Ai），每个浓度平行试验3次。无水甲醇溶液与所配置的DPPH溶液1∶1混合后，测其在517 nm处的吸光值（A0）;将无水甲醇溶液与样品溶液1∶1混合，测其在517 nm波长处的吸光值（Aj）。将测得数据代入下式计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1. 8. 2 ABTS自由基清除能力测定 参考Re等（1999）的方法，略加改动。精密称取0.0384 g ABTS和0.0134 g过硫酸钾，用超纯水分别定容至10.0 mL，混匀后于4 ℃条件下避光放置16 h，得到7 mmol/L ABTS自由基储备液;使用前用95%乙醇对其进行稀释，使其在734 nm处的吸光值达0.7±0.02。将不同质量浓度（10～160 µg/mL）的样品和Trolox溶液分别加入配置好的ABTS自由基溶液（体积比1∶1），室温下暗反应0.25 h，测其在734 nm波长处的吸光值（Ai）;测定ABTS自由基溶液与95%乙醇1∶1混合后在734 nm波长处的吸光值（A0）;测定95%乙醇溶液与样品溶液1∶1混合后在734 nm波长处的吸光值（Aj）。将数据代入下式进行计算，得到各样品的ABTS自由基清除率：

ABTS自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1. 9 统计分析

利用SPSS 21.0、Excel 2016和Origin 8.0对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 方法学考察结果

2. 1. 1 稳定性试验结果 结果显示，搁置4 h以内的RSD为0.26%（n=6），小于2%，表明供试品溶液在制备显色后4 h内稳定。

2. 1. 2 精密度试验结果 测得总黄酮含量分别为9.56%、9.49%、9.56%、9.53%、9.49%和9.51%，平均值为9.52%，RSD=0.31%（n=6），小于2%，表明仪器精密性良好。

2. 1. 3 重复性试验结果 测得赫章县青胡桃中总黄酮的平均含量为9.51%，RSD=0.39%（n=6），表明该总黄酮含量测定方法的重复性良好。

2. 1. 4 加样回收试验结果 由表1可知，平均回收率为97.47%，RSD为1.26%（n=9）。

2. 2 青胡桃不同溶剂萃取物中总黄酮含量测定结果

由表2可知，不同萃取溶剂对青胡桃中总黄酮含量有明显影响，以粗提物（80%乙醇提取物）中的总黄酮含量最高，石油醚、乙酸乙酯和水3种溶剂萃取物的总黄酮含量均显著低于80%乙醇提取物的总黄酮含量（P<0.05）。

2. 3 不同产地青胡桃中总黄酮含量测定结果

从表3可看出，贵州省不同产地青胡桃样品间的总黄酮含量均无显著差异（P>0.05），其中花溪区和天柱县的青胡桃总黄酮含量最高，均为9.61%，其次为云岩区、纳雍县和白云区，总黄酮含量均为9.58%，以斗蓬山的青胡桃总黄酮含量最低，为9.36%。

2. 4 青胡桃不同溶剂萃取物的抗氧化活性比较结果

因不同产地样品间的总黄酮含量相差不明显，且赫章县为贵州省胡桃最主要产地，故选取赫章县样品进行体外抗氧化活性试验。不同溶剂萃取物对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的曲线方程、相关系数及半抑制浓度（IC50）如表4所示。根据IC50评价青胡桃不同溶剂萃取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力的强弱，IC50越小，清除能力越强。

2. 4. 1 DPPH自由基清除能力测定结果 从表4可知，80%乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物清除DPPH自由基的IC50分别为27.39、144.78和52.35 µg/mL，石油醚萃取物在检测范围内对DPPH自由基清除能力始终较低，4种萃取物的相关系数分别为0.997、0.999、0.999和0.999。青胡桃不同溶剂萃取物对DPPH自由基的清除效果如图1所示，4种溶剂萃取物的清除能力随溶液质量浓度的增加而增强，且在10～160 µg/mL质量浓度范围内呈明显的量效关系;当质量浓度为160 µg/mL时，80%乙醇提取物、Trolox和水萃取物对DPPH自由基清除率分别为92.66%、92.42%和87.75%，均具有较强的抗氧化能力。各萃取物在低浓度时均表现出对DPPH自由基的清除能力小于Trolox，但粗提物在质量浓度达80 µg/mL后对DPPH自由基的清除能力与Trolox相当。石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物的DPPH自由基清除能力相似，对DPPH自由基清除能力均较弱。相同质量浓度下各萃取物对DPPH自由基清除能力排序为80%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。

2. 4. 2 ABTS自由基清除能力测定结果 由表4可知，80%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物清除ABTS自由基的IC50分别为30.81、146.34、114.60和49.46 µg/mL，相关系数分别为0.989、0.999、0.999和0.996。从图2可看出，青胡桃不同溶剂萃取物对ABTS自由基均有一定的清除能力，且呈明显量效关系;随着青胡桃不同溶剂萃取物质量浓度的增加，清除ABTS自由基的能力逐渐增强，但清除率均低于同等质量浓度的Trolox清除率，其中80%乙醇提取物和水萃取物在質量浓度达160 µg/mL时对ABTS自由基的清除能力与Trolox的清除能力相近。相同质量浓度下各萃取物对ABTS自由基清除能力排序为80%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。

3 讨论

本研究对青胡桃不同溶剂萃取物的抗氧化活性进行评价，结果表明，青胡桃对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的排序均为80%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。其中80%乙醇提取物的抗氧化能力最强（清除DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分别为27.39和30.81 µg/mL），与胡桃楸种仁壳粗提液（用60%乙醇、料液比1∶31、超声波功率250 W、超声波时间31 min进行超声波辅助提取所得）（清除DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分别为2.76和33.26 µg/mL）（徐红艳等，2012）相比，青胡桃粗提物清除ABTS自由基的能力更强。张卫星等（2014）在核桃青皮提取物的抗菌和抗氧化活性研究中发现核桃青皮各提取相均有不同程度的抗氧化能力，其中乙酸乙酯相和氯仿相的抗氧化能力远强于其他各相;邵冬冬等（2018）对昆仑雪菊不同溶剂萃取物的抗氧化活性进行研究，发现正丁醇部位对DPPH自由基清除能力最强，乙酸乙酯部位对OH自由基清除能力最强。本研究结果与张卫星等（2014）、邵冬冬等（2018）的不同相间抗氧化能力排序结果不同，可能与试验样品、样品部位、产地、采收时间等存在差异有关。本研究中，青胡桃不同溶剂萃取物的抗氧化能力强弱顺序与青胡桃不同溶剂萃取物的总黄酮含量顺序一致，因此得出青胡桃中抗氧化活性成分可能为总黄酮。青胡桃的抗氧化活性随总黄酮质量浓度的增加而增强，与张福平等（2013）研究发现黄皮叶黄酮类化合物对油脂的抗氧化能力随总黄酮质量浓度的增加而增强的结果相同。本研究中，同种溶剂萃取物在相同质量浓度下对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力存在差异，即同种溶剂萃取物对不同自由基清除作用具有选择性。

本研究在总黄酮含量测定中选取10个不同产地的青胡桃;在抗氧化活性评价中将不同极性部位作为研究对象，研究内容与形式较传统方法更严谨，研究结果也更具可比性、系统性和科学性，为贵州青胡桃的深入研究提供参考依据和新思路。但本研究中抗氧化活性评价考察因素较少，未能确定青胡桃中起抗氧化能力的具体成分。因此对超氧阴离子自由基、OH自由基等还原能力进行考察，确定青胡桃中生物活性成分，同时展开对其药动及药效学的过程研究将是今后研究的重点。

4 结论

建立的青胡桃中总黄酮含量测定方法简单、快速、便捷，其线性、稳定性、精密度、重复性和回收率良好。青胡桃具有较强的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂进行开发，具有较好的功能性食品和药品开发前景。

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（責任编辑 罗 丽）