水稻滞绿突变分子遗传研究进展

刘凯　严国红　张桂云　孙明法

摘要：水稻是中国最重要的粮食作物，水稻滞绿突变的分子遗传研究对于延缓水稻衰老以及提高水稻生物产量方面具有重要的意义。本文从植物滞绿突变的概念、分类，水稻滞绿突变基因的克隆与功能分析，以及在水稻高产育种上的应用进行了综述，探讨水稻滞绿突变基因的分子遗传机制，以期为水稻超高产育种及挖掘水稻高产潜力的种质资源提供理论依据。

关键词：水稻;滞绿;突变;分子遗传

中图分类号：S511

文献标识码：A

文章编号：1000-4440（2019）02-0484-05

高等植物的衰老是植株在细胞、组织、器官上的衰退过程，而叶片衰老最直观的表现是叶绿体向着有色体转化，叶绿素发生降解以及光合能力的大幅度下降。植物滞绿突变体（Stay greenmutant）是指植株在叶片衰老过程中叶绿素不发生降解或降解不明显，尤其是在植株生长发育后期，叶片能够保持绿色较长时间，甚至不完全黄化，并且保持較强的光合作用。因此，滞绿突变体的特殊表型在提高农作物产量方面显示了巨大潜力，同时高等植物叶绿素降解代谢途径的调控机理研究对延缓植物衰老也具有重要意义。

水稻是中国主要的粮食作物，也是基因功能研究的模式植物。提高水稻叶片中的叶绿素含量，可以增加水稻的生物产量，因而具有超高产潜力的水稻品种往往表现为植株光合作用能力强，后期不早衰，抗逆性也显著高于一般品种。水稻收获籽粒中80%以上的干物质是开花以后通过光合作用获得的中，一些水稻滯绿突变体的叶片在成熟期依旧保持浓绿色，进行着较强的光合作用，在提高水稻产量方面展现出一定的潜能。因此本文综述了水稻滞绿突变体相关基因的克隆与功能分析，并对其在水稻超高产育种及挖掘水稻高产潜力的种质资源方面的应用作了展望。

1 植物滞绿突变的概念

植物在生长发育的后期，叶片会逐渐由绿变黄，发生衰老现象，然而Thomas等[2]1987年在草地羊茅（Festuca pratensis）中发现1株突变体（sid），叶片在后期未发生黄化，通过对突变体的离体暗培养，发现叶片中的叶绿素含量并未发生下降，对照（野生型）植株叶绿素发生明显降解。之后研究者利用物理和化学诱变的方法在辣椒（Capsicum annum）[3]、高粱（Sorghum bicolor）[4]、水稻（Oryza sativa）[5]、烟草（Nicotiana tabacum）[6]和拟南芥（Arabidopsis thali-ana）[7]中相继发现了类似的突变体。

2 植物滞绿突变体的分类

根据Thomas等[8]的研究，将植物滞绿突变体分为5种类型。A型：突变体和野生型植株的叶绿素降解速率和光合速率基本一致，但突变体衰老起始比较晚;B型：叶绿素降解和光合作用下降起始时间相同，但是滞绿突变体降解的速率变慢;C型：叶绿素降解受到抑制，叶绿素含量直至叶片衰老后期始终保持相对稳定，与野生型相同;D型：遭遇突发的自然灾害，造成叶片坏死，叶绿素被永久固定在叶片当中，光合作用停止并导致植株死亡;E型：突变体叶片相比野生型在成熟后期依旧保持较高的叶绿素含量。

此外，上述5种类型的滞绿突变体根据其植株衰老的起始时间和衰老进程的快慢，又可以分为功能型和非功能型2种基本类型。其中，A类和B类表型都能够延缓植株衰老，属于功能型的滯绿突变体（Functional stay-greenæmutant），如果将功能型的滞绿突变体的基因转入其他农作物中，可能会提高其生产能力和生物产量，Gan等[9]利用转基因技术获得1个烟草滞绿突变体，其植株的生物产量和种子产量分别增长了40%和52%;C、D、E类型中滞绿突变体表型和植株衰老的起始时间和速率都没有显著的相关性，属于非功能型持绿突变体（Non-func-tional stay-green mutant）。

3 水稻滞绿突变基因克隆

植物叶片中叶绿素分解代谢途径发生突变，常会导致植物生长后期的滞绿表型，突变后叶片中叶绿素的降解明显延缓或受阻，由于具有容易观察的表型，滞绿突变体被广泛用来研究植物的叶片衰老、果实成熟和叶绿素降解。目前水稻中已克隆的与叶片滞绿相关的基因有24个：ODOS、OABC1-2、NYC1、Cga1、RLS1、OPAO、OFBK12、NOL、PHYB、PHYA、PHYC、ZOGTl、Z0GT2、SGRL、OTZF1、NYC3、OSIK2、TDC2、NYC4、TDC1、OSGR、SUB1A、

ORCCRI、ONAC5（表1）[10-27]。

其中已经克隆到10个水稻滞绿突变基因与叶绿体发育及叶绿素降解途径相关，分别是OSGR、SGRL、NYC1、NOL、RLS1、NYC3、OPAO、ORCCRI、OABC1-2、NYC4。

OsSGR是Jiang等[25]通过γ射线辐射水稻品种日本晴发现的1个与水稻叶绿素降解途径相关的基因，该基因被定位于水稻第9染色体，编码1个高度保守的蛋白质，是具有水溶性的转运肽，亚细胞定位于类囊体膜上，在转录水平影响叶绿素的降解。Cha等[28]研究发现OsSGR的功能与叶绿素降解调控有关，通过激发多个叶绿素降解酶（例如NYC、PPH、RCCR PAO）等直接与LHCPII（light-harvestingcomplex II，LHCPII）结合，在类囊体膜上形成SGR-LHCPII复合物，诱导LHCPII降解，促进叶绿素的降解。Jiang等[29]通过暗诱导水稻衰老的叶片，0sSGR基因上调表达，这说明OSGR与植株的衰老是密切相关的，同时过量表达OSGR基因能使叶片中类囊体片层结构减少，叶片黄化，叶绿素含量也减少，加速叶绿素的降解。此外OSGR基因不仅存在于低等植物中，同时也存在于多种高等植物中，例如胡椒[30]、拟南芥[31]、豌豆[32]和番茄133]中。水稻SGRL是OSGR的同源基因，通过氨基酸序列的比对显示，两者的氨基酸序列具有高度的同源性，体现在氨基酸序列的中间区域都含有1个高度保守的区域，不同之处在于OSGR编码氨基酸序列C端具有1个半胱氨酸的结构域，而SGRL不具有[34]。

Kusaba等[1]在水稻中发现另1个滞绿突变体基因NYC1，突变体在叶片衰老过程中一直保持绿色。图位克隆将NYC1定位于第1染色体，它编码1个带有3个跨膜结构域的短链脱氢还原酶。通过电镜观察突变体叶片中的叶绿体，发现即使在叶片衰老后期也能观察到大而密的叶绿体基粒。虽然NYCI编码的蛋白质在体外不具有叶绿素b还原酶的活性，但另外1个滞绿基因NOL编码的蛋白质具有叶绿素b还原酶的活性，所以Kusaba推断NOL和NYC12个基因编码具有不同功能的叶绿素b还原酶。进一步研究发现NYC和NOL都定位于类囊体膜上，两者在体外可以互作，只有当NYC和NOL形成复合体的时候，才可以行使叶绿素b还原酶的功能，催化叶绿素b还原成叶绿素a，同时催化LHCPII的降解[35]。当NYC1突变后，叶绿素b和LHCPII以及类囊体基粒的降解都被抑制，不能与NOL发生结合，因而叶片一直保持绿色，说明NYC1和NOL两者在调节植物叶片叶绿素b降解和LHC-PII降解中发挥重要作用。

Morita等[21]利用电离辐射获得了NYC3突变体。图位克隆发现该基因位于水稻第6染色体着丝粒附近，编码1个ax/B折叠水解酶家族蛋白，可能是叶绿素酶，但没有叶绿素酶的活性。NYC3在正常衰老叶片中的表达量很低，而在暗诱导后叶片中表达量很高，在其他非光合组织中如根部也有少量表达。NYC3突变体在黑暗诱导衰老叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量比野生型高，其他参数如F./F和细胞膜离子渗漏等指标都下降，说明NYC3是1个非功能型持绿突变体。NYC3突变体表型特征与OSGR突变体类似，但NYC3/ossgr双突变体在叶片衰老后期滞绿表型没有显著增强。

Jiao等[13]发现水稻滞绿基因RLS1，该基因被定位于水稻第2染色体上，编码1个含有NB-ARM结构域的蛋白，该基因在水稻叶片衰老过程中参与自噬调节的叶绿体降解途径，暗诱导以后，RLSI基因上调表达。OPAO编码1个脱镁叶绿素a氧化酶，它在植株中是组成型表达，通过ABA能够诱导植株成熟，研究发现OSGR和OsPAO同时都是上调表达的，而且两者都受到细胞分裂素的抑制，敲除OPAO基因后会使得转基因植物快速死亡[14]。ORCCR1编码1个叶绿素代谢产物还原酶，在叶片衰老的过程中表达上调，敲除后在水稻的叶片上会出现类病斑而导致植株死亡[14]。OABC1-2是Gao等[12]在水稻品种dongjin中发现的T-DNA插入突变体，该基因定位于水稻第2条染色体上，编码1个蛋白激酶，暗诱导可以显著抑制该基因的表达，过表达OABC1-2却可以提高植株对黑暗诱导的胁迫响应能力。

Yamatani等[24]利用碳粒子束获得了另一个水稻滞绿突变体，定名为NYC4，图位克隆将该基因定位于第7染色体，为拟南芥THF1的同源基因[36]，而THF1编码1个多功能蛋白，参与植物体内糖信号转导、抗病和高光驯化等过程[37-38]。NYC4编码1个类囊体形成蛋白THF1，主要控制叶绿体中类囊体的形成，在叶绿素降解过程中起重要作用。对突变体进行暗处理后受衰老诱导且与叶绿素降解相关的基因如OSGR、NYC3、NYC1、NOL、ORCCR1、OPAO以及其他衰老诱导基因Oh36都得到上调表达，表明NYC4体内的衰老进程并未受阻，NYC4是非功能型突变体。然而与其他滞绿突变体如NYC1、OSGR、NOL和NYC3不同的是，在衰老的过程中NYC4的叶绿素荧光参数如F、/F与野生型相比，维持在较高水平，且PSII亚基的稳定性也比其他非功能型突变体的好。

4 展望

植物叶片的衰老和滞绿表型是植物进化中形成的生态适应性，也是植物生长和繁殖的重要过程，具有重要的生物学意义。滞绿突变体是研究植物光合作用、叶绿素代谢以及植物早衰和抗逆境重要的材料来源，因此对植物滞绿表型的研究可以深入阐明叶片中叶绿素代谢途径与光合作用的相关性。

研究发现水稻籽粒灌浆后期绝大多数的碳水化合物来自于水稻植株倒三叶的光合作用产物，这表明水稻上部功能性叶片的早衰会直接影响水稻的灌浆结实，陆定志等[39]认为水稻功能性叶片每推迟1d衰老，生物产量可以提高1%，因而植物的滞绿表型对产量和品质具有很大的促进作用。目前通过突变体以及基因工程技术已经分离克隆到水稻相关的滞绿基因达20多个，但大多数都是非功能型的突变体，现在能直接用于水稻分子育种的基因只有SNU-SG140。SNU-SG1是在粳稻中发现的滞绿突变体基因，该突变体在水稻成熟后期叶片一直保持绿色，并且植株的光合作用能力依旧很强，是目前发现的唯一1个具有育种利用价值的滞绿突变体[41]。研究发现在同样的环境下，SNU-SGl突变体较其他高产品种叶片中含氮量更高，表明这种功能型的滞绿突变体在水稻成熟后期叶绿素降解的速率缓慢，光合作用时间更长，根系能够高效吸收营养[42]，

笔者所在课题组于2014年在中熟中粳稻盐稻8号提纯复壮的试验田中发现1株衰老明显延缓的滞绿突变体。经连续多年的种植，表型稳定遗传，在自然条件下，突变体在苗期、分蘖期、灌浆初期的表型与野生型盐稻8号无显著差异，但在灌浆后期叶色仍保持浓绿，尤其是千粒质量极显著高于野生型。目前我们已将该基因定位在第4染色体遗传距离为4.6cM的范围内，此定位区间内没有已报道的与水稻叶绿素代谢相关的基因。同时也以突变体为亲本配置了大量杂交组合，以期为培育高产水稻品种提供种质资源。随着水稻滞绿基因功能研究的深入，植物的滞绿机制将会被进一步详细阐明，同时利用分子标记辅助选择将有利基因進行聚合育种，在农业生产上将会具有更广阔的应用前景。参考文献：

[1]黃国勤，彭剑锋.水稻早衰的原因及其防治措施[J].现代农业科技，2007（10）：130.

[2]THOMAS H.Sid：a mendelian locus controlling thylakoid membrane disassembly in senescing leaves of Festuca pretenses [J].Theoretical & Applied Genetics，1987，73（4）：551-555.

[3]SMITH P G.Inheritance of brown and green mature fruit color inpeppers[J].Journal of Heredity，1950，41（5）：138.

[4]VICTOR D M，CRALLE H T，MILLER F R.Partitioning of 14C-Photosynthate and biomass in relation to senescencecharacteristicsof sorghum[J].Crop Science，1989，29（4）：1049-1053.

[5]MONDAL W A，CHOUDHURI M A.Comparison of phosphorus mobilization during monocarpic se nascence in rice cultivars with sequential and non-sequential leaf senescence[J].Physiologia Plantarum，2010，65（3）：221-227.

[6]CRAFTSBRANDNER S J，LEGGETTJ E，SUTTON T G，et al.Effect of root system genotype and nitrogen fertility on physiological differences between burley and flue-cured tobacco.I.single leaf measurements 1[J].Crop Science，1987，27（3）：535-539.

[7]ZACARIAS L，REID M s.Role of growth regulators in the senescence of Arabidopsis thaliana leaves[J].Physiologia Plantarum，1990，80（4）：549-554.

[8]THOMAS H，HOWARTH CJ.Five ways to stay green[J].Journal of Experimental Botany，2000，51：329-337.

[9]GAN S，AMASINO R M.Inhibition of leaf senescence by autoreg-ulated production of cytokinin[J].Science，1995，270（5244）：1986-1988.

[10]KONG Z，LI M，YANG W，et al.A novel nuclear-localized CCCH-Type zinc finger protein，OsDOS，is involved in delaying leaf senescence in rice[J].Plant Physiology，2006，141（4）：1376.

[11]KUSABA M，ITO H，MORITA R，et al.Rice NON-YELLOW COLORING1 is involved in light-harvesting complex II and granadegradation during leaf senescence[J].The Plant Cell Online，2007，19（4）：1362-1375.

[12]GAO Q，YANG Z，ZHOU Y，et al.Characterization of an Abe I kinase family gene OsABCI-2，conferring enhanced tolerance to dark-induced stress in rice[J].Gene，2012，498（2）：155-163.

[13]JIAOB B，WANG J J，ZHU X D，et al.A novel protein RLS1 with NB-ARM domains is involved in chloroplast degradation during leaf senescence in rice[J].Molecular Plant，2012，5（1）：205-217.

[14]TANG Y，LI M，CHEN Y，et al.Knockdown of OsPAO and OsRCCR1 cause different plant death phenotypes in rice[J].Jourmal of Plant Physiology，2011，168（16）：1952-1959.

[15]HUDSON D，GUEVARA D R，HAND A J，et al.Rice cytokinin GATA transcription Factor1 regulates chloroplast development and plant architecture[J].Plant Physiology，2013，162（1）：132-144.

[16]CHEN Y，XU Y，LUO W，et al.The F-box protein OsFBK12 targets OsSAMSI for degradation and a facts pleiotropic phenotypes，including leaf senescence，in rice[J].Plant Physiology，2013，163（4）：1673-1685.

[17]JUMTEE K，0KAZAWA A，HARADA K，et al.Comprehensive metabolite profiling of phyA phyB phyC，triple mutants to reveal their associated metabolic phenotype in rice leaves[J].Journal ofBioscience & Bioengineering，2009，108（2）：151-159.

[18]KUDO T，MAKITA N，KOJIMA M，et al.Cytokinin activity of cis-Zeatin and phenotypic alterations induced by over expression of putative cis-Zeatin-O-glucosyl transferase in rice[J].Plant Physiology，2012，160（1）：319-331.

[19]JAN A，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K.OsTZF1，a CCCH-Tan-dem zine finger protein，confers de layed senescence and stress tolerance in rice by regulating stress-related genes[J].Plant Physiology，2013，161（3）：1202-1216.

[20]RONG H，TANG Y，ZHANG H，et al.The stay-green rice like（SGRL）gene regulates chlorophyll degradation in rice[J].Journal of Plant Physiology，2013，170（15）：1367-1373.

[21]MORITA R，SATO Y，MASUDA Y，et al.Defect in non-yellow coloring 3，an alpha/beta hydrolase-fold family protein，causes astay-green phenotype during leaf senescence in rice[J].PlantJournal，2009，59（6）：940-952.

[22]CHEN LJ，WURIYANGHAN H，ZHANG Y Q，et al.An S-Do-main receptor-like kinase，OsSIK2，confers abiotic stress to leranceand delays dark-induced leaf senescence in rice[J].Plant Physiology，2013，163（4）：1752-1765.

[23]KANG K，KIM Y S，PARK S，et al.Senescence-induced serotonin biosynthesis and its role in delaying senescence in rice leaves[J].Plant Physiology，2009，150（3）：1380-1393.

[24]YAMATANI H，SATO Y，MASUDA Y，et al.NYC4，the rice or-tholog of Arabidopsis THF1，is involved in the degradation of chlo-rophyll-protein complexes during leaf senescence[J].Plant Journal，2013，74（4）：652-662.

[25]JIANG H，LI M，LIANG N，et al.Molecular cloning and function analysis of the stay green gene in rice[J].Plant Jourmal，2007，52（2）：197-209.

[26]FUKAO T，YEUNG E，BAILEYSERRES J.The submergence tolerance gene SUB1A delays leaf sense cense under prolonged dark-ness through hormonal regulation in rice[J].Plant Physiology，2012，160（4）：1795-1807.

[27]SPEROTTO R A，RICACHENEVSKY F K，DUARTEGL，et al.Identification of up-regulated genes in flag leaves during rice grainfilling and characterization of OsNAC5，a new ABA-dependent transcription factor[J].Planta，2009，230（5）：985-1002.

[28]CHAK W，LEE Y J，KOH H J，et al.Isolation，characterization，and mapping of the stay green mutant in rice[J].Theoretical andApplied Genetics，2002，104（4）：526-532.

[29]JIANG H，CHEN Y，LI M，et al.Over expression of SGR results in oxidative stress and lesion-mimic cell death in rice seedlings [J].Journal of Integrative Plant Biology，2011，53（5）：375-387.

[30]EFRATI A，EYAL Y，PARAN I.Molecular mapping of the Chlorophyll retainer（cl）mutation in pepper（Capsicum spp.）and screening for candidate genes using tomato ESTs homologous to structural genes of the Chlorophyll catabolism pathway[J].Ge-nome，2005，48（2）：347-351.

[31]RENG，AN K，LIAO Y，et al.Identification of a novel Chloroplast protein AtNYE1 regulating Chlorophyll degradation during leaf senescence in Arabidopsis [J].Plant Physiol，2007，144：1429-1441.

[32]AUBRY s，MANI J，HoRTENSTEINER S.Stay-green protein，defective in Mendel' s green cotyledon mutant，acts in dependent and upstream of Pheophorbide a oxygenase in the Chlorophyll catabolic pathway[J].Plant Mol Biol，2008，67：243-256.

[33]BARRY C S，MCQUINN R P，CHUNG M Y，et al.Amino acid substitutions in homologs of the STAY-GREEN protein are responsible for the green-flesh and chlorophyll retainer mutations of toma-to and pepper[J].Plant Physiology，2008，147（1）：179-187.

[34]PILKINGTON S M，MONTEFIORI M，JAMESONP E，et al.The control of chlorophyll levels in maturing kiwifruit[J].Planta，2012，236（5）：1615-1628.

[35]SATO Y，MORITA R，KATSUMA s，et al.Two short-chain dehydrogenase/reductases，NON-YEL LOW COLORING 1 and NYC1-LIKE，are required for chlorophyll b and light-harvesting complexII degradation during senescence in rice[J].The Plant Jourmal，2008，57（1）：120-131.

[36]WANG Q，SULLIVAN R W，KIGHT A，et al.Deletion of the chloroplast-localized Thylakoid for mationl gene product in Arabi-dopsis leads to deficient thylakoid formation and variegated leaves[J].Plant Physiology，2004，136（3）：3594-3604.

[37]KEREN N，OHKAWA H，WELSH E A，et al.Psb29，a conserved 22-kD protein，functions in the biogenesis of photosystem IIcomplexes in Synechocystis and Arabidopsis[J].The Plant CellOnline，2005，17（10）：2768-2781.

 [38]WANGDI T，UPPALAPATIS R，NAGARAJS，et al.A virus induced gene silencing screen identifies a role for Thylakoid Formation1 in Pseudomonas syringae pv tomato symptom development in tomato and Arabidopsis[J].Plant Physiology，2010，152（1）：281-292.

[39]陸定志，潘裕才，马跃芳，等.杂交水稻抽穗结实期间叶片衰老的生理生化研究[J].中国农业科学，1988，21（3）：21-26.

[40]张宝来.水稻叶片衰老的研究进展[J].天津农业科学，2013，19（4）：19-24.

[41]ZHANG H.Quantitative trait loci associated with functional stay-green SNU-SG1 in rice[J].Molecules & Cells，2007，24（1）：83-94

[42]FUJ D，YAN Y F，LEE B W.Physiological characteristics of a functional stay-green rice ‘ SNU-SG1’during grainilling period[J].Jourmal of Crop Science & Biotechnology，2009，12（1）：47-52.