寄主对斜纹夜蛾实验种群生殖力的影响

蒋立奔 林硕 陈勇 余芸 陈艺欣 田厚军 魏辉

摘 要：【目的】斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius是一种多食性害虫，繁殖能力强，全球范围内均有分布。但是寄主对斜纹夜蛾繁殖力影响机制还不清楚。开展寄主对斜纹夜蛾实验种群生殖力的影响研究，为斜纹夜蛾的预测预报以及防治提供理论依据。【方法】通过单头饲养的方法，研究斜纹夜蛾取食甘蓝、空心莲子草和地瓜后的产卵量、卵黄原蛋白（Vg）及卵黄原蛋白受体（VgR）表达的变化。【结果】幼虫取食不同寄主的成虫寿命和产卵前期没有显著性差异，但成虫的产卵量、Vg及VgR表达量有显著差异。取食人工饲料的斜纹夜蛾产卵量最多，为（889±43.0）粒，其次为取食地瓜（496±53.1）粒、空心莲子草（362±37.3）粒，和甘蓝（193±9.7）粒。取食甘蓝、空心莲子草和地瓜的斜纹夜蛾雌虫卵巢Vg和VgR的相对表达量仅为取食人工饲料斜纹夜蛾的40%～80%，且取食不同寄主的斜纹夜蛾Vg和VgR的相对表达量与产卵量呈正相关关系。【结论】斜纹夜蛾取食不同寄主后，其卵巢内的Vg和VgR表达量存在差异，从而影响到斜纹夜蛾卵子发育，最终造成其生殖力存在差异。

关键词：斜纹夜蛾;产卵量;卵黄原蛋白;卵黄原蛋白受体

中图分类号：S 435文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）02-235-06

0 引言

【研究意义】在长期的协同进化过程中，昆虫与寄主植物之间形成了形式多样、相互联系和相互适应的关系。寄主植物的特性（营养物质种类和含量）在植食性昆虫的生长繁殖中起到重要作用，特别对昆虫种群繁殖能力有重要的调节作用[1-3]。因此，明确寄主植物对害虫生殖能力影响机制对害虫综合治理和预测预报具有重要意义。【前人研究进展】昆虫生殖调控的关键步骤就是卵黄发生，卵黄发生的研究对于昆虫繁殖力的控制具重要意义[4]。卵黄原蛋白（Vitellogenin， Vg）作为卵黄蛋白的前体，由脂肪体合成后运送到血淋巴，再通过卵黄原蛋白受体（Vitellogenin receptor， VgR）内吞作用摄取。卵黄原蛋白分子在脂肪体中被蛋白水解，通过翻译前和翻译后的修饰，促进碳水化合物、脂质和其他营养物质运输到卵巢，为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素和微量元素等营养和功能性物质[5-7]。近年来通过干扰昆虫的生殖功能，使其不能交配或繁衍后代，从而实现害虫的有效治理是昆虫学研究的热点之一。斜纹夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）属鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性、暴食性害虫，广泛分布于亚洲、大洋洲、太平洋西岸、中东等许多国家和地区，也是我国重要农业害虫之一[8]。已有报道斜纹夜蛾的寄主范围包括蔬菜、花卉、果树、烟草、草坪、灌木、乔木等109 科389 种植物[9-10]，具有很强的繁殖能力和远距离迁飞能力，严重危害时可造成作物严重减产，甚至绝收，给农业生产造成巨大的损失[11-12]。【本研究切入点】目前对斜纹夜蛾的防治仍以化学防治为主，而杀虫剂的大量使用，导致斜纹夜蛾对多种杀虫剂产生了抗性[13]。有效天敌的匮乏与抗药性是目前斜纹夜蛾防治工作的主要障碍。因此，探索防治斜纹夜蛾的高效、环保新途径迫在眉睫。前人研究表明斜纹夜蛾取食不同寄主后生殖能力有显著差异[14-16]，但主要集中研究其生物学及生理指标，其内在分子机制还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究选取空心莲子草、甘蓝和地瓜作为寄主，研究其对斜纹夜蛾雌蛾生殖能力的影响，一方面可以从分子水平闡释不同寄主模式下雌蛾产卵差异的内在机制，另一方面为减少农药使用，减缓其抗药性的产生，控制斜纹夜蛾种群增长以及生态调控提供一个可能途径，具有重要的实践价值。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与作物

斜纹夜蛾幼虫采自福建省农业科学院植物保护研究所蔬菜试验田（未喷施农药），室内利用单卵块筛选2代，在未接触任何杀虫剂的条件下以人工饲料（主要成分为玉米粉、黄豆粉、白糖、酵母粉、抗坏血酸等）连续饲养3年以上。饲养条件是温度27℃，相对湿度75%～80% RH，光照12∶12 （L∶D）。

供试作物为空心莲子草Alternanthera philoxeroides （Mart.） Griseb、甘蓝Brassica oleracea L.和地瓜Ipomoea batatas （L.） Lam，分别种植在试验田中，未喷施农药。

1.2 成虫产卵量测定

将同一天孵化的初孵幼虫单头放人直径5 cm塑料培养皿中，分别饲喂空心莲子草叶片、甘蓝叶片和地瓜叶片，每天更换寄主植物叶片，以人工饲料为对照。待成虫羽化后，将雌雄配对置于塑料盒（长×宽×高=12 cm×12 cm×18 cm）中，并饲以10%的蜂蜜水。盒底放置纱布（长×宽=12 cm×12 cm），供雌蛾产卵。每天更换蜂蜜水和产卵纱布，记录成虫的产卵数量直至其死亡。每组处理30对成虫。饲养条件同1.1。试验重复3次。

1.3 斜纹夜蛾卵巢获取

分别收集取食不同寄主植物的羽化后1、2、3、4、5、6、7、8 d的斜纹夜蛾雌虫，虫体固定在底部置有冰盒的蜡盘中，倒入一定量磷酸盐缓冲盐水（PBS： 137 mmol·L-1 NaCl; 2.7 mmol·L-1 KCl; 8 mmol·L-1 Na2HPO4; 1.5 mmol·L-1 KH2PO4; pH 7.5）没过虫体。在体视显微镜下，虫体背面向上，用剪刀剪出T字形开口，拉开体壁并固定。取出卵巢置于离心管中。解剖后的样品置于液氮中暂存。每天收集10只雌虫，试验重复3次。

1.4 卵巢总RNA提取及qRT-PCR

斜纹夜蛾卵巢组织的RNA提取采用Trizol（Invitrogen）法[17]。利用Primer5.0软件设计斜纹夜蛾SlVg（EU095334）、SlVgR（LOC111350990）和β-Actin（DQ494753）（扩增片段大小约为150～250 bp）引物（表1）。RT-PCR分别获得SlVg、SlVgR和β-Actin基因的cDNA模板。荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green PCR MasterMix kit （Promega Crop） 10 μL，cDNA模板2 μL，引物各0.4 μL，RNase-free H2O 7.2 μL。反应程序：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃15 s，40循环。每个样品设置3个重复。获得的CT值利用2-△△CT计算SlVg和SlVgR基因的相对表达水平。

1.5 數据分析

文中数据均采用平均值±标准误表示，采用SPSS 17.0软件进行One-way ANOVA分析。

2 结果与分析

2.1 不同寄主对斜纹夜蛾成虫产卵及寿命的影响

图1显示，幼虫取食人工饲料、甘蓝、空心莲子草和地瓜的成虫寿命没有显著差别（F=1.71， df1=3， df2=8， P=0.264），但成虫的产卵量有显著不同（F=19.82， df1=3， df2=8， P=0.001）。取食人工饲料的斜纹夜蛾产卵量达到单雌（889±43）粒，显著高于取食地瓜（496±53.1）粒、空心莲子草（362±37.3）粒和甘蓝（193±9.7）粒（图1）。此外，由图2看出，幼虫取食人工饲料、甘蓝、空心莲子草和地瓜的成虫产卵前期均为2 d，羽化后第3～5 d为产卵高峰期，此后日均产卵量逐渐降低。

2.2 不同寄主对斜纹夜蛾成虫卵巢Vg和VgR的影响

通过RT-qPCR分析取食不同食物对斜纹夜蛾成虫卵巢Vg和VgR的影响，结果表明，取食不同食物的斜纹夜蛾Vg和VgR的mRNA相对表达量呈正相关关系，均在羽化后1～2 d达到峰值，随后开始下降，到第8 d时仅为峰值的20%～30%（图3）;同时，取食甘蓝、空心莲子草和地瓜斜纹夜蛾雌虫Vg和VgR的相对表达量仅为取食人工饲料斜纹夜蛾的40%～80%。此外，比较取食不同食物的斜纹夜蛾雌虫日均产卵量与Vg和VgR的mRNA相对表达量发现，在Vg和VgR表达量达到峰值后2～3 d，斜纹夜蛾日均产卵量达到高峰期（图2～3），表明雌虫产卵量与Vg和VgR表达量呈正相关关系。

3 讨论与结论

许多昆虫可危害多种寄主植物，由于不同寄主植物所含有的营养成分不同，从而对幼虫和蛹的生长发育会产生一定的影响，同时也会对成虫的产卵能力有较大影响[2， 18-19]。研究表明，取食人工饲料的斜纹夜蛾幼虫存活率显著高于取食棉花、甘蓝和大豆[16]。本研究结果表明，取食甘蓝、空心莲子草和地瓜对斜纹夜蛾雌成虫的寿命无显著影响，与涂业苟等[16]、栾玉柱等[20]研究结果相似。但是，取食甘蓝、空心莲子草和地瓜的斜纹夜蛾产卵量显著低于取食人工饲料，与前人研究结果差异较大[16， 18-20]，这可能由不同地理种群差异造成的。这些试验结果说明，斜纹夜蛾在取食不同品种的寄主之后，虽然对雌成虫寿命无影响，但是对其生殖能力仍有较大影响。这可能与不同品种寄主植物叶片中蛋白质和微量元素等含量不同，以及叶片中苯酚类等抗虫组分不同有关[21-22]。因此，不同寄主植物对斜纹夜蛾种群的增殖可能有较大的影响，人工饲料是开展实验种群饲养的理想食料。

昆虫卵子发生是营养型，营养的缺失可能会抑制Vg的合成及卵子的发育[23]。本研究表明，取食3种不同寄主植物的斜纹夜蛾卵巢中Vg的相对表达量显著低于取食人工饲料的斜纹夜蛾，该结果与取食不同食物的斜纹夜蛾日均产卵量一致。此外，斜纹夜蛾卵巢中VgR的表达量与Vg表达趋势一致。因此，我们猜测取食不同寄主植物后斜纹夜蛾体内Vg基因表达水平的差异最终导致了斜纹夜蛾生殖的差异。同时，昆虫卵黄原蛋白从合成启动到被卵母细胞特异性吸收均受卵发育神经分泌激素（EDNH）、保幼激素（JH）和蜕皮激素（MH）等昆虫激素的调节[24]。姚晓明[3]研究发现取食甘蓝的蜕皮激素含量最低而保幼激素含量明显高于取食其他的寄主植物。因此，我们推测取食甘蓝、空心莲子草和地瓜的斜纹夜蛾体内Vg表达水平低于取食人工饲料，可能是寄主品质差异导致体内激素含量等指标的差异，从而调控Vg基因的表达与合成，最终表现出产卵量的差异。取食甘蓝、空心莲子草和地瓜对斜纹夜蛾体内关键激素影响与生殖能力的关系还需要进一步研究。

本试验的结果初步说明，取食甘蓝、空心莲子草和地瓜的斜纹夜蛾产卵量显著低于取食人工饲料，取食不同食物的斜纹夜蛾日均产卵量动态变化与卵巢中Vg和VgR相对表达量一致，该结果为进一步研究斜纹夜蛾卵子发生机制奠定理论依据，也为斜纹夜蛾的预测预报以及防治提供理论依据。

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（责任编辑：林海清）