O78血清型大肠杆菌对蛋鸡的致病性及丙/丁酸单甘油酯的保护效果

刘玉涛 凌清标 黄宝钦 吴学敏 王隆柏 周伦江

摘 要：【目的】研究O78血清型大肠杆菌对蛋鸡的致病性，以及单甘油酯对蛋鸡O78血清型大肠杆菌不同致病方式的保护效果，为绿色无抗养鸡提供理论支撑和实践经验。【方法】对福建省某鸡场分离的血清型O78禽源致病性大肠杆菌（APEC），采用口服、颈部皮下和气管内壁接种不同日龄的试验鸡，评价菌株的致病性，建立攻毒模型，然后评估以丙酸单甘油酯、丁酸单甘油酯为主要成分的水溶性液态添加物FraC34对鸡大肠杆菌病的保护效果。【结果】（1）12日龄海兰蛋鸡雄雏口服接种细菌3.0×109CFU·羽-1，可造成100%发病;但22日龄海兰蛋鸡雄雏分别口服接种细菌3.0×109CFU·羽-1和6.0×109CFU·羽-1时不发病。12日龄海兰蛋鸡雄雏颈部皮下接种细菌0.4×109CFU·羽-1，可造成70%的试验鸡发病，22日龄海兰蛋鸡雄雏气管内壁接种细菌1.5×109CFU·羽-1，可造成25%鸡只发病;（2）在饮水中添加FraC34，早期可改善鸡肠道健康，降低肠道对APEC的易感性，在饮水中添加2～3 L·m-3的FraC34，能够显著降低经由口服途径感染APEC造成的发病率和死亡率，还能够降低经气管内壁接种APEC所造成的死亡率，并且显著降低发病率;当饮水添加3 L·m-3时，可以维持感染鸡的日增重。【结论】鸡O78血清型的APEC对幼雏具有极大的危害性，造成严重经济损失，而中大雏对该菌株具有一定的耐受性;养殖环节添加FraC34，对于鸡感染APEC具有一定的保护作用，并且可以维持鸡的生产性能，可替代部分抗生素的使用，达到较为理想的保护效果。

关键词：禽致病性大肠杆菌;丙/丁酸单甘油酯;海兰蛋鸡;保护效果

中图分类号：S 852.612文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）02-209-05

0 引言

【研究意义】大肠杆菌是一类广泛存在于自然界，并能引起人和动物共同感染的重要人畜共患病病原，依其致病机制可分为3类：共生型、肠内致病型和肠外致病型。肠外致病型大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic E.coli， ExPEC）是定植于宿主肠道外其他组织、并严重致病的一类新的大肠杆菌菌群，是一类危害严重的人兽共患病病原，可分为尿道致病性大肠杆菌（UPEC）、脑膜炎/败血症相关大肠杆菌（MNEC）和禽致病性大肠杆菌 （APEC） 等[1]。APEC对养禽业造成巨大的危害，并且还可通过食物传播;污染的饮水、食品会引起疾病暴发流行，因此也是一种重要的食源性病原[2-3]。APEC可通过其特有的毒力因子，如黏附素（P和S型菌毛、1型菌毛和Afa/Dr黏附素）、毒素（溶血素和细胞毒性坏死因子1）、表面抗原（K1、K5和K12荚膜和脂多糖）、侵袭素、离子摄取系统和分泌系统，侵袭、定殖于胃肠外组织，规避或破坏宿主防御机制，并诱发感染[4-5]，引起鸡的心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、脐炎、眼炎等疾病，对养鸡业危害严重。目前随着养鸡业工厂化、标准化、集约化，饲养密度也随之增加，APEC的发病率呈上升态势，因此研究APEC的主要致病途径和安全用药意义重大。【前人研究进展】APEC血清型众多，但O78血清型是福建省APEC优势血清型，流行率超过50%[6]，具有广泛的代表性。最近几十年，养殖业饲用抗生素的大量长期添加使用，影响了自然界均衡的微生物环境，造成病原的适应性变异和细菌耐药性增加，也导致动物自身免疫下降、疾病频发和采食量减少，并对人类健康造成威胁[7]，因此禁止将抗生素作为饲料添加剂在食品动物饲料中添加使用已成为世界各国政府和学者的共识与必然趋势，欧盟于2006年全面禁止抗生素作为饲料添加剂使用，我国农业部也已在2017年全面禁止硫酸黏杆菌素作为饲料添加剂使用，并且开始对其他抗生素启动再评估工作，因此寻找安全有效的饲用抗生素替代品已成为全球研究的热点。目前主流的抗生素替代品有益生菌、酸化剂、中草药、植物提取物等种类[8]。单硬脂酸甘油酯多年来被作为乳化剂、膨松剂广泛应用于食品及医药工业[9]，具有延长食品保存期的作用，无论是短链、中链，还是长链脂肪酸单甘酯，都具有一定的抗菌或抑菌活性。已有试验表明甘油酯类物质也具有替代抗生素的功能，NAMKUNG H等研究证实单丁酸甘油酯对伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium和产气荚膜梭菌Clostridium perfringens具有抗菌活性[10]，张希等通过体外抑菌试验，发现中链饱和脂肪酸单甘油酯对致病性大肠杆菌（Escherichia Coli） O157：H7和白色念珠菌Candida albicans具有较强的抑菌活性[11]。【本研究切入点】前人对APEC的研究多集中在流行病学、病原鉴定，以及抗生素、中草药和益生菌等对APEC的防治效果，有关福建省APEC的优势血清型O78的致病方式鲜见报道;另一方面，甘油酯作为一种新型制剂，前人研究多为体外抑菌试验，鲜见针对感病蛋鸡在临床应用方面的研究。【拟解决的关键问题】本试验通过评价血清型O78 APEC的致病性，建立攻毒模型，然后通过添加FraC34（商品名：艾希托，以丙酸单甘油脂、丁酸单甘油酯为主要成分），观察FraC34对鸡致病性大肠杆菌病的防治效果，以期为绿色无抗养鸡提供必要的理论支撑和实践经验。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

APEC：2012年分离自福建省某鸡场的典型大肠杆菌病例，经鉴定血清型为O78，用该菌株37℃、20 h营养肉汤培养物，接种4日龄海兰蛋鸡雄雏0.2 mL·只-1，致死率为100%，平均死亡時间为15.25 h，具有很强的致病力。试验菌株接种到营养肉汤内，置于摇床，37℃培养18～20 h，计算试验菌液的菌落单位数（CFU），在使用时根据试验需求用新鲜营养肉汤稀释使用。

1.2 供试材料

FraC34，由佰高威盛（上海）动物药业有限公司提供，黄棕色黏稠液体，主要成分为：丙酸单甘油脂≥ 31%，丁酸单甘油酯≥ 8%，丙酸钠≥ 3%。

1.3 试验动物及APEC致病性

试验动物为海兰蛋鸡1日龄健康公雏，由福州农工商种禽公司提供。试验鸡隔离饲养于动物房，1～5日龄，在饮水中添加电解多维，饲养至7日龄，而后进行分组，每组20只鸡，分2个单元，每个单元10只鸡。试验鸡均饲养于相同环境中，由专人管理，经不同途径接种（表1）后，于每日7∶00～22∶00时段，每隔3 h观察1次，至接种后第7 d，观察临床表现，记录死亡情况，并做好病死鸡的剖检记录。同时设营养肉汤对照和不接种对照，各20只鸡。人工感染后第8 d将全部幸存鸡扑杀，剖检观察其病变，出现典型大肠杆菌病病变的鸡，视为发病鸡，合并计入发病数，并在平均死亡时间项目中进行加权。必要时做细菌分离培养。

1.4 单甘油酯保护效果

FraC34效果评估试验共设A、B、C、D、E、F 6个处理;A1组、B1组分别于6日龄在饮水中投以1.0、1.5 L·m-3的FraC34，C1组、D1组分别于12日龄在饮水中投以2.0、3.0 L·m-3的FraC34，E1组、F1组只投喂清水作为对照。口服接种前停料2 h，停水1 h，口服攻毒后0.5 h再投喂饲料和饮水，A1、B1、C1、D1、E1组于12日龄通过口服接种3.0×109CFU的O78血清型鸡大肠杆菌，F1组不攻毒，观察7 d，记录发病死亡情况，在19日龄试验期结束时，对存活鸡称重，计算各组的平均体重。A2组、B2组分别于16日龄在饮水中投以1.0、1.5 L·m-3的FraC34，C2组、D2组分别于22日龄在饮水中投以2.0 、3.0 L·m-3的FraC34，E2组、F2组只投喂清水作为对照，A2、B2、C2、D2、E2组于22日龄通过气管内壁接种1.5×109CFU的O78血清型鸡大肠杆菌，F2组不攻毒，观察7 d，记录发病死亡情况，在29日龄试验期结束时，对存活鸡称重，计算各组的平均体重。

2 结果与分析

2.1 O78不同接种途径对蛋鸡的致病性

O78菌液经口服、颈部皮下、气管内壁接种海兰蛋鸡雄雏，均可以造成试验鸡发病和死亡。在口服接种时，当12日龄接种3.0×109CFU·羽-1的菌液，可造成试验鸡100%的发病，并且死亡率达30%，而当22日龄接种时，接种同样剂量或更高剂量的菌液，试验鸡未出现发病病例和死亡;当通过颈部皮下接种12日龄试验鸡时，造成70%的发病率;通过气管内壁对22日龄试验鸡接种菌液1.5×109CFU·羽-1时，其发病率可达到25%，死亡率为5%（表1）。

2.2 FraC34对感染蛋鸡的保护效果

2.2.1 FraC34对12日龄蛋鸡口服接种O78的保护效果

结果显示，当在饮水中添加FraC34时，能够降低由口服感染APEC所造成的发病死亡率，且A1B1C1D1组的日增重均好于阳性感染E1组，尤其FraC34在2.0～3.0 L·m-3的添加量时能够显著降低发病率和死亡率（表2）。

2.2.2 FraC34对22日龄蛋鸡气管壁接种O78的保护效果

在22日龄时，每只鸡通过气管内壁接种1.5×109CFU的O78血清型APEC，7 d后观察，结果显示（表3），当水中添加2.0～3.0 L·m-3的FraC34时，能够显著降低由气管内壁接种感染APEC所造成的发病死亡率，且在3.0 L·m-3时，FraC34可以维持较好的日增重。

3 讨 论

APEC作为肠外致病性大肠杆菌，可造成鸡肠外组织感染导致死亡[11]。本研究对临床分离的一株血清型为O78的APEC菌株通过接种途径进行毒力评价。通过口服、颈部皮下注射、气管内壁接种该APEC菌株，均可以造成试验鸡的发病死亡和肠外组织感染，具有很强的致病性。接种的试验鸡，20 h之内死亡的病鸡，一般多无特征性病变，偶尔见到肌肉、肺脏、肾脏的充血出血。心包炎出现的时间一般在接种菌液22 h之后;肝周炎出现的时间稍迟，一般在38 h之后;气囊炎造成的肉眼可见的混浊病变，一般出现在接种菌液100 h之后。

口服接种所需的菌液剂量较大，且随着日龄增加，APEC的致病力下降，表明22日龄的海兰蛋鸡雄雏的肠道黏膜屏障功能完整，可以抵御强致病性大肠杆菌的攻击;颈部皮下接种所需菌液剂量较小，并且具有很高的发病率和死亡率，死亡时间短;气管内壁接种22日龄鸡，与口服接种相比，也可以造成一定的发病率（25%）和死亡率（5%），因此鸡感染APEC的严重程度因感染日龄、感染量、感染途径的不同而出现明显的差异，在养殖过程中，一定要降低鸡舍的粉尘和氨气，避免外伤，可减少APEC的感染和发病率。

丙酸单甘油脂和丁酸单甘油酯作为FraC34的主要有效成分，在维护肠道黏膜屏障功能的完整性和抵御肠道有害致病菌方面起到重要的作用[12]，如能够抑制和杀灭肠道有害菌APEC，维护黏膜完整性，降低APEC经由肠道感染鸡的风险。因此，本试验在饮水中添加FraC34，可以降低APEC感染引起的发病率和死亡率，尤其在2～3 L·m-3剂量时，能够显著降低鸡经由口服感染APEC所造成的发病和死亡。此外FraC34具有维护肠道黏膜完整性的作用，还可以改善感染APEC肉鸡的日增重，弥补由于感染引起的生长性能降低。

APEC的另一个重要感染途径是经由呼吸道感染，2～3周龄以上的鸡只以呼吸道感染为主[13]，虽FraC34的体内代谢途径目前還不明确，但本试验通过气管内壁接种O78血清型APEC，发现FraC34在较高浓度时对APEC感染具有保护作用，当在饮水中添加2.0～3.0 L·m-3时，可以较好地控制发病率和死亡率，尤其发病率显著降低，并且添加3.0 L·m-3时，可以维持较好的日增重，有助于改善体况，因此FraC34不仅具有改善肠道健康的作用，在鸡体内还发挥着全身性的作用，从而改善部分由于呼吸道疾病引起的损失。

通过本研究结果表明：本实验室临床分离的优势血清型O78APEC菌株为强致病性菌株，可以作为研发生物制品的候选菌株，亦可以成为动物保健产品有效性评估的攻毒菌株。此外，通过不同途径接种的致病结果提示，在养殖过程中需要加强管理，避免呼吸道感染和外伤感染APEC，可降低APEC的发病率和死亡率，提高养殖效益。同时在2周龄之前的雏鸡饮水中添加2.0 L·m-3的FraC34和2周龄之后的中大鸡在饮水中添加3.0 L·m-3的FraC34，可以降低经由肠道和呼吸道感染APEC所造成的发病率和死亡率，并且在一定程度上还可以维持较好的日增重，增加经济效益。通过本研究对FraC34在APEC感染鸡的效果评估试验，说明FraC34在替代抗生素治疗鸡的部分细菌病方面具有一定的潜力和效果，可以作为抗生素替代品用于鸡的细菌病的防控，减少抗生素使用。

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（责任编辑：翁志辉）