多指标综合评分法正交试验优选红芽姜制半夏的炮制工艺

赖 昕，严国鸿，张 华，刘永静，徐 伟，褚克丹，孙承韬

（1.福建中医药大学药学院，福建，福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院，福建，福州 350004）

半夏（Pinelliae Rhizoma）为天南星科植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.) Breit.）的干燥块茎，性温、味辛，具有燥湿化痰、降逆止呕的功效，有微毒性，故临床上多使用其炮制品。其中，姜半夏是半夏炮制品中最为常用的品种，生半夏炮制为姜半夏后，能缓和药性，具有降低唇舌刺痛肿胀、咽喉肿痛、呕吐或腹泻等毒副作用[1]，同时增强降逆止呕作用，故其临床应用广泛。辅料姜为药食同源物质，是临床常用中药，也是中药炮制的主要辅料。红芽姜作为姜的主要来源之一，在福建栽培历史悠久，品质优良，纤维少，它是制备姜汁的优质原料[2]。福建以红芽姜为炮制辅料的姜半夏品质优，质量稳定，占广药供应量的10%。其中，6-姜酚为生姜中含量最高的姜酚类化合物，具有抗炎、抗氧化等药理作用，亦是起到止呕功效的活性物质[3-4]。同时，中国药典将白矾限量作为姜半夏的检查项目。

2015年版《中国药典》中姜半夏的炮制方法无明确的工艺参数，缺乏客观、量化的质量标准。本研究以6-姜酚含量、有机酸含量和白矾残留量为考察指标，通过正交试验法考察红芽姜的用量、白矾用量和煮制时间，结合多指标综合评分法优选红芽姜制半夏的最佳炮制工艺，从而确定炮制工艺参数，为红芽姜制半夏饮片的加工和质量标准的建立提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(美国Thermo Scientific公司，UltiMate3000型)；Milli-Q纯水器(美国millipore公司)；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，CAP225D型）；精密酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司，PHS-3C型）；箱式电阻炉（上海钜晶精密仪器制造有限公司，SXL-1200C型）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ-500DE型）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司，HH-Z型）；磁力搅拌器（常州市金坛区环宇科学仪器厂，79-1型）；电热套（天津泰斯特仪器有限公司，98-I-B型）。

1.2 药材

生半夏和红芽姜均来自福建承天药业有限公司，经福建中医药大学药学院褚克丹教授鉴定为天南星科植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.) Breit.）的干燥块茎和姜科植物红芽姜（Zingiber officinaleRosc.）的新鲜根茎。

1.3 试剂

6-姜酚（含量 ＞ 98%，批号：113429-201406，中国食品药品检定研究院）；琥珀酸对照品（批号：110896-201602，中国食品药品检定研究院）；含水硫酸铝钾[KAl(SO4)2·12H2O]（分析纯，化学纯度＞ 99.5%，上海麦克林生化科技有限公司）；乙腈为色谱纯（德国 Merck公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 红芽姜制半夏炮制工艺正交试验设计及样品制备

2.1.1 正交试验因素水平

《中国药典》2015年版中，姜半夏炮制辅料用量规定为：每100 kg净半夏，用生姜25 kg、白矾12.5 kg。药典未规定具体炮制时间，因此，本研究以姜半夏传统炮制工艺为参考，根据现行方法结合前期试验情况，对炮制过程中的红芽姜用量（g）、白矾用量（g）及炮制时间（h）3个因素各选取 3个水平，依据 L9(34)正交表进行正交试验设计优选红芽姜制半夏的炮制工艺，各因素水平见表 1，炮制辅料用量按每100 g半夏药材计。

2.1.2 红芽姜制半夏炮制样品制备

自制红芽姜半夏依据《中国药典》2015年版姜半夏项下制法进行炮制：称取净半夏，大小分开，用水浸泡至内无干心时，取出；另取红芽姜切片适量煎汤，加白矾适量与半夏共煮透（炮制），取出，晾至半干，干燥。按上述方法制备得不同因素水平红芽姜制半夏炮制样品。

表1 正交设计因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2.2 红芽姜制半夏中6-姜酚含量的测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（45:55）；检测波长：282 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL；流速：0.8 mL·min-1；理论板数不低于 5000。在上述色谱条件下，6-姜酚成分峰能够与其他杂质成分完全分离，结果见图1。

图1 6-姜酚对照品（A）及红芽姜制半夏炮制品（B）液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of 6-gingerol and processed products of Pinellia

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取6-姜酚对照品适量，加入甲醇制备成质量浓度为0.53 mg·mL-1的对照品储备液，精密移取对照品储备液1.0 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得含有6-姜酚21.2 μg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

称取干燥后的红芽姜制半夏各炮制品粉末（过65目筛）5.0 g，置具塞锥形瓶中，加入10倍量甲醇超声提取2次（功率500 W，频率40 kHz），每次30 min，合并上清液，水浴浓缩后定容至50 mL，摇匀后0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液进行测定。

2.2.4 线性关系考察

取“2.2.2”项下对照品溶液分别按2、5、10、15、20 µL进样测定峰面积，以对照品进样量（µg）为横坐标X，色谱峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，计算回归方程为：

结果表明6-姜酚在0.0424～0.4240 µg范围内，进样量（µg）与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度考察

取“2.2.2”项下对照品溶液连续进样6次，记录峰面积，计算 6-姜酚色谱峰面积的 RSD值为0.74%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性考察

取同一红芽姜制半夏炮制品 6份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液进样分析，记录6-姜酚色谱峰面积，计算 6-姜酚平均含量为0.0191%（0.191 mg·g-1），RSD 值为 1.54%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性考察

取同一红芽姜制半夏炮制品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后的0、1、2、4、8、12、24 h进样，计算6-姜酚色谱峰面积的RSD值为1.49%（n=7），表明所制备供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 加样回收率考察

称取已知6-姜酚含量（0.19 mg·g-1）的红芽姜制半夏样品3.0 g共6份，置于锥形瓶中，分别精密移取质量浓度为0.53 mg·mL-1的6-姜酚对照品溶液1.0 mL，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算 6-姜酚的平均回收率为 98.15%，RSD值为1.88%（n=6）。

2.2.9 样品含量测定

依据L9(34)正交表因素水平，取照“2.1”项下方法炮制的红芽姜制半夏样品，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样，测算色谱峰面积，计算6-姜酚含量。

2.3 有机酸含量测定

本研究根据《中国药典》中半夏项下的有机酸含量测定方法[5]，以琥珀酸作为对照品，对红芽姜制半夏中的有机酸含量进行测定。

2.3.1 标准滴定液的配制

参照2015年版《中国药典》（四部）所规定的配制方法[6]，分别配制氢氧化钠滴定液（0.1 mol·L-1）和盐酸滴定液（0.1 mol·L-1），备用。

2.3.2 对照品溶液的配制

取琥珀酸对照品102 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解后定容至刻度线，即得每1.0 mL含有1.02 mg的琥珀酸对照品溶液，备用。

2.3.3 供试品溶液的配制

称取红芽姜制半夏粉末（过65目筛）5.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL的乙醇回流提取3次，每次 1 h，放冷滤过，合并滤液，蒸干，残留物精密加入氢氧化钠滴定液（0.1mol·L-1）10 mL溶解，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min后转移至50 mL量瓶中，加入新煮沸的冷水定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.4 测定方法

按照2015年版《中国药典》（四部）通则0701电位滴定法[6]测定，精密量取“2.3.3”项下供试品溶液25 mL，用盐酸滴定液（0.1 mol·L-1）滴定。以盐酸滴定液消耗的体积（V）为横坐标，以ΔE/ΔV（即相邻 2次的电位差与加入滴定液的体积差之比）为纵坐标，绘制滴定曲线。ΔE/ΔV的极大值对应的体积即为滴定终点，滴定结果用空白试验校正。计算得每1.0 mL氢氧化钠滴定液（0.1mol·L-1）相当于5.904 mg的琥珀酸（C4H6O4）。

2.3.5 精密度考察

精密量取“2.3.2”项下对照品溶液20 mL，加入氢氧化钠滴定液（0.1 mol·L-1）10 mL，摇匀后用盐酸滴定液（0.1 mol·L-1）滴定，记录滴定终点所消耗盐酸滴定液体积，滴定结果用空白试验校正。平行5次试验，计算RSD值为0.85 %（n=5），表明本方法精密度良好，符合要求。

2.3.6 重复性考察

取同一红芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.3.3”项下方法制备5份供试品溶液，照“2.3.4”项下方法测定，计算有机酸的平均含量为 0.8093%（8.093 mg·g-1），RSD 值为 0.74 %（n=5）,表明本方法重复性良好，符合测定要求。

2.3.7 稳定性考察

取同一红芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后每隔 2 h测定1次，共测6次，计算RSD值为1.29 %（n=6），表明供试品溶液在制备后10 h内稳定，符合测定要求。

2.3.8 加样回收率考察

称取已知有机酸含量（8.09 mg·g-1）的红芽姜制半夏样品2.0 g共5份，置于锥形瓶中，分别精密移取质量浓度为1.02 mg·mL-1的琥珀酸对照品溶液10 mL，之后按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.4”项下方法测定，计算有机酸的平均回收率为96.72 %，RSD值为1.69 %（n=5）。

2.3.9 样品含量测定

依据L9(34)正交表因素水平，取照“2.1”项下方法炮制的红芽姜制半夏样品，照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.4”项下方法测定并计算有机酸含量。

2.4 白矾含量测定

本研究根据《中国药典》中清半夏项下的白矾限量测定方法[5]，以含水硫酸铝钾[KAl(SO4)2·12H2O]作为对照品，对红芽姜制半夏中的白矾残留量进行测定。

2.4.1 指示剂和滴定液的配制

参照2015年版《中国药典》（四部）所规定的配制方法[6]，分别配制甲基红、二甲酚橙指示液和锌滴定液(0.05 mol·L-1) 、乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 滴定液(0.05 mol·L-1)，备用。

2.4.2 供试品溶液的配制

称取红芽姜制半夏粉末（过65目筛）5.0 g，置坩埚中加热至完全炭化后移入箱式电阻炉中450 ℃灰化4 h，取出待冷却后在坩埚中加入稀盐酸10 mL，用表面皿覆盖坩埚水浴加热 10 min后表面皿用5.0 mL热水冲洗，洗液并入坩埚中，滤过，50 mL 水分次洗涤坩埚及残渣，将洗液合并至滤液，加入0.025 %的甲基红乙醇液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色。加入醋酸-醋酸铵缓冲液（pH 6.0）20 mL，再精密加入 EDTA（0.0523 mol·L-1）25 mL，煮沸3～5 min，放冷，加二甲酚橙指示剂1.0 mL，即得供试品溶液。

2.4.3 测定方法

以锌滴定液（0.0518 mol·L-1）滴定“2.4.2”项下供试品溶液自黄色转变为红色，滴定结果用空白试验校正。计算得每 1.0 mL的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）滴定液（0.05 mol·L-1）相当于23.72 mg的含水硫酸铝钾（KAl（SO4）2·12H2O）。

2.4.4 精密度考察

精密称定含水硫酸铝钾对照品 0.3 g，按“2.4.2”项下方法“加入稀盐酸10 mL”起操作，记录滴定终点所消耗锌滴定液体积，滴定结果用空白试验校正。平行5次试验，计算RSD值为0.91 %（n=5），表明本方法精密度良好，符合要求。

2.4.5 重复性考察

取同一红芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.4.2”项下方法制备5份供试品溶液，照“2.4.3”项下方法测定，计算白矾的平均含量为7.951%（79.51 mg·g-1），RSD值为0.67 %（n=5），表明本方法重复性良好，符合测定要求。

2.4.6 稳定性考察

取同一红芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后每隔 1 h测定1次，共测7次，计算RSD值为1.17 %（n=7），表明供试品溶液在制备后6 h内稳定，符合测定要求。

2.4.7 加样回收率考察

称取已知白矾含量（79.51 mg·g-1）的红芽姜制半夏样品2.0 g共5份，置于锥形瓶中，精密称取含水硫酸铝钾对照品150 mg，之后按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.4.3”项下方法测定，计算白矾的平均回收率为97.53 %，RSD值为1.56 %（n=5）。

2.4.8 样品含量测定

依据L9(34)正交表因素水平，取照“2.1”项下方法炮制的红芽姜制半夏样品，照“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.4.3”项下方法测定并计算白矾残留量。

2.5 正交设计试验和结果

按照“2.1”项下炮制方法，依据L9(34)正交表（表 1）的条件进行试验，优选红芽姜制半夏的炮制工艺。选取红芽姜用量（A）、白矾用量（B）及炮制时间（C）3个因素，以 6-姜酚、有机酸和白矾含量为指标，采用多指标综合评分法对试验结果进行分析，试验采用“隶属度”对指标进行评价。对于以最大值为优的指标（如 6-姜酚含量），其指标隶属度为：（指标值-指标最小值）/（指标最大值-指标最小值）；对于以最小值为优的指标（白矾残留量），其指标隶属度为：（指标最大值-指标值）/（指标最大值-指标最小值）

其中半夏所含的有机酸是产生其呼吸系统药理作用（包括止咳、祛痰、平喘等）的主要有效成分[7]，6-姜酚则为炮制辅料红芽姜中的主要有效成分，为含量最高的姜辣素类化合物，具有较高的生物活性[8]，均按40%的权重计分，白矾残留量按20%的权重计分。因此，综合分数=6-姜酚含量隶属度×40%＋有机酸含量隶属度×40%＋白矾残留量隶属度×20%，满分为1。评分结果以综合分数作为总指标进行方差分析，正交试验结果见表 2，各指标方差分析见表3。

正交试验和方差分析结果表明，各个因素对红芽姜制半夏炮制工艺的影响顺序是 A（红芽姜用量）＞B（白矾用量）＞C（炮制时间）。其中，红芽姜用量对试验指标的影响具有显著性差异，白矾用量以及炮制时间均无显著影响。L9(34)正交试验的分析结果表明，综合评分为0.6718的炮制工艺A3B3C2为最优水平组合，但由表2可知，炮制时间（C列）的极差R值最小且其K1＞K2，综合考虑实际生产省时方便，最终确定红芽姜制半夏的炮制工艺为A3B3C1。即，优选工艺为：每100 g净半夏，加入红芽姜30 g，白矾15 g，炮制时间为4 h。

表2 正交试验结果表Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 各指标方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.6 验证试验

取净半夏，按正交试验所优选出的红芽姜制半夏炮制工艺进行炮制，分别按上述方法测定有机酸含量、6-姜酚含量以及白矾残留量，平行三次试验，结果见表4。结果显示：经过所优选的炮制工艺（A3B3C1）炮制的红芽姜制半夏中6-姜酚和有机酸含量高，白矾残留量符合药典标准，各项指标稳定，达到预期结果，表明所优选的工艺符合实际，可以作为红芽姜制半夏的炮制方法

表4 工艺验证试验Table 4 Results of verification tests

3 讨论

半夏为天南星科植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.) Breit.）的干燥块茎，临床上多使用其炮制品，主要包括生半夏、清半夏、姜半夏和法半夏。其中，姜半夏是半夏炮制品中最为常用的品种，具有温中化痰、降逆止呕的功效。2015年版《中国药典》虽记载了姜半夏的炮制方法，但各地药材品质差异较大，炮制过程影响因素较多，含量测定多限于有机酸而无生姜相关指标成分；且对于其中的关键工艺：“另取生姜切片煎汤，加白矾与半夏共煮透”，详于定性、略于定量，无明确的工艺参数（如煮制时间），缺乏客观、量化的质量标准。

红芽姜化学成分复杂，其中姜辣素类成分是姜属植物中特有的成分，也是生姜中起抗炎、解热、抗癌等作用的有效部位，其中6-姜酚含量最高[8]。本试验选择红芽姜制半夏中6-姜酚的含量为有效成分指标之一，采用HPLC法测定其含量，同药典质量标准相比较，使该饮片的质量控制标准更加客观、量化。有机酸作为半夏的主要有效成分，具有镇咳、平喘等多种生物活性[9]，半夏经白矾炮制后，饮片中铝残留较高，若长期摄入过量铝离子，容易诱发老年痴呆等疾病。

因此，本研究基于现行《中国药典》规定的方法，利用正交设计法同时考察了红芽姜制半夏中6-姜酚、有机酸和白矾残留量3种指标。其中6-姜酚和有机酸的含量宜高，而白矾的含量宜低，因此，通过多指标综合评分法设立“隶属度”，再根据各项指标对其炮制品质量影响的重要程度，将6-姜酚和有机酸的权重比例均设为40%，白矾残留量的权重比例设为20%，以此计算综合评分（总分为1）。优选出红芽姜制半夏的最佳炮制工艺为：每100 g净半夏，加入红芽姜30 g，白矾15 g，炮制时间为4 h。优选的姜半夏炮制工艺中，生姜与白矾用量均较药典炮制方法有所增加，但使红芽姜制半夏中的有效成分保持较高的含量，其中有机酸含量显著高于药典标准，同时白矾残留量低于药典所规定的8.5%。本研究优选的炮制工艺具有一定合理性，为红芽姜制半夏饮片的加工提供理论依据，具有重要指导意义，同时测定了有效成分的含量为炮制工艺提供了定量指标，为红芽姜制半夏质量标准的建立奠定基础。

致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室，福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。