白蛾周氏啮小蜂繁育坏蛹病原菌传播机制的研究

马春艳，闫丰军*，郑召坤，安 静，王婷婷

（1.日照市自然资源和规划局，山东 日照276800；2.日照市岚山区巨峰镇农技站，山东 日照 276800）

白蛾周氏啮小蜂是美国白蛾等鳞翅目食叶害虫的重要寄生性天敌。利用柞蚕蛹繁育释放周氏啮小蜂已是一项成熟的技术，但繁育过程中柞蚕蛹的烂蛹问题十分严重，严重影响繁育效率，增加繁育成本。用于繁育的柞蚕蛹是按照原国家林业局制定的质量检验标准[1]严格挑选的，但总体烂蛹率仍时常高达30%，有时高达50%以上，甚至在个别繁育箱中柞蚕蛹全部烂掉。程瑞春等[2]认为柞蚕灵菌败血病是坏蛹的主要病原菌。程瑞春等[3]利用抗生素对3个病原菌菌株进行了抑菌试验，结果显示即使采用最好的抗生素注射预防，仍有大约30%蚕蛹因发生细菌病害而使小蜂败育。其他解决柞蚕蛹坏蛹的方法主要是对繁蜂环境和柞蚕蛹都进行消毒。典型试验研究如张宁等[4]采用酒精、新洁尔灭以及消毒柜等不同方法对柞蚕蛹进行了消毒研究。童玲等[5]对腐烂蚕茧中的细菌进行了鉴定研究，同时认为柞蚕茧蛹的消毒与否与柞蚕蛹腐烂率无关。要减少坏蛹应首先应探索导致坏蛹的病原菌在繁育过程中的传播机制，然后有针对性地采取措施，从而降低病原菌的传播几率。本文通过进行大量试验，对小蜂繁育过程中坏蛹病原菌传播机制进行了深入研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

柞蚕蛹由烟台志芳养殖公司从辽宁省购进。白蛾周氏啮小蜂种蛹由烟台市森保站提供。

繁育箱为木盒0.5m*0.6 m*0.3 m的木盒，底盒和盖均为厚0.01 m的泡桐板。

试验用针头是医用最细的注射用针头。

小蜂浸泡离心液，是将出蜂1 d后的5个种蛹及小蜂浸泡1 h后，用离心机离心30 min，取底层浓缩但无杂质部分作为试验用注射液。

1.2 试验方法

为研究周氏啮小蜂繁育过程中柞蚕蛹坏蛹病原菌的传播机制，本研究设计了9个处理。试验前，将柞蚕蛹按照健康蛹的感官标准分拣好，再混匀，然后均匀放置在繁育箱中，并于同一时间接蜂；接蜂后隔2 d即第4 d开箱，挑拣出坏蛹，此后每隔一天进行一次坏蛹挑拣，直到10 d后结束分拣，检查统计各个繁育箱的柞蚕蛹总量和坏蛹数量，计算坏蛹率。所有试验均在同一繁蜂室内进行，繁蜂温度控制在25℃、湿度保持在60%。

1.2.1 杀菌灯照射后不接蜂然后封箱

接蜂前先用40 w杀菌灯照射30 min，照射距离大于1 m，不接蜂，然后再封箱。本处理的研究目的是验证坏蛹病原菌是否通过空气传播。

1.2.2 不用杀菌灯照射不接蜂然后封箱

不用杀菌灯照射，将繁育箱直接蜂箱。本处理作为处理1的对照。

1.2.3 封闭木箱接蜂

接蜂后将繁蜂箱的木盖迅速盖上并用胶带缠绕封闭好，防止小蜂逃逸。本处理方法是当前各地通用的接蜂方法。

1.2.4 用无菌医用针头扎

用医用针头扎后，封箱。本处理设计目的是查验坏蛹是否是因柞蚕蛹体不带毒的健康小蜂产卵器刺伤引发。

1.2.5 用蘸过坏蛹液针头扎

坏蛹含有大量导致坏蛹的病原菌。用蘸有坏蛹体液的针头扎柞蚕蛹的体壁，是模拟周氏啮小蜂雌蜂产卵的过程，如出现坏蛹率高于用干净针头扎的情况，则可进一步验证坏蛹是由带病周氏啮小蜂产卵导致。

1.2.6 注射小蜂浸泡离心液

本试验是检验白蛾周氏啮小蜂成蜂是否携带坏蛹病菌，如坏蛹率显著高于注射蒸馏水的柞蚕蛹，则可确认小蜂成蜂携带坏蛹病原菌。

1.2.7 注射蒸馏水

注射蒸馏水的处理作为注射小蜂浸泡离心液的对照。

1.2.8 柞蚕蛹蘸坏蛹液

柞蚕蛹蘸取坏蛹体液封箱后，观察统计坏蛹率，如坏蛹率很低则说明坏蛹病原菌并不能通过体表接触传播。

1.2.9 用与坏蛹相处1 h的小蜂接蜂

用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂，如坏蛹率明显高于杀菌灯照射后不接蜂封箱和不用杀菌灯照射不接蜂封箱，则可进一步确认坏蛹病菌是通过小蜂产卵传播。

1.3 数据分析

试验数据用Excel整理，利用SPSS 21进行试验数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 坏蛹病原传播机制试验结果

2.1.1 各试验坏蛹率均值（见表1）

表1 各试验处理坏蛹率均值Table1 Mena value of bad pupa percent of treatments

2.1.2 坏蛹率均值多重比较

通过SPSS 21分析，不同试验间差异非常显著，但方差非齐性（见表2、表3），故采用单因素方差分析中没有齐性要求的 Tamhane、Dunnett T3、Games-Howell和Dunnett C比较法对各试验均值进行多重比较（见表4）。

表2 坏蛹率单因素方差分析组间差异显著性Table2 The differences of groups of bad pupa percent with single factor analysis of variances

表3 坏蛹率方差齐性检验Table3 Homogeneity test of variances of bad pupa percent

2.2 试验结果分析

2.2.1 鉴于“杀菌灯照射后不接蜂封箱”、“不用杀菌灯照射不接蜂封箱”，二者坏蛹率无显著差异，表明坏蛹病原菌不能随空气传播。二者坏蛹率显著小于“封闭木箱接蜂”、“用蘸过坏蛹液针头扎”的，而显著大于“用干净针头扎”表明，坏蛹病原菌可通过带毒物体刺穿健康柞蚕蛹传播，而小蜂产卵是重要的传播途径。

表4 试验数据的多重比较Table4 Multiple comparisons of experimental data

比较方法(I)处理方式 (J)处理方式 均值差(I-J) 标准误 显著性注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂0.2003625*0.1889375-0.1349625 0.1511000-0.7774625*0.0607750 0.1524750-0.0799250 0.1395875*0.1281625*-0.1957375 0.0903250-0.8382375*-0.0607750 0.0917000*-0.1407000 0.0418043 0.0417994 0.0813111 0.0503185 0.0417431 0.0437953 0.0426028 0.0656401 0.0134404 0.0134254 0.0710250 0.0310645 0.0132491 0.0437953 0.0157496 0.0523610 0.068 0.093 0.984 0.323 0.000 1.000 0.248 1.000 0.000 0.001 0.354 0.434 0.000 1.000 0.003 0.637 Tamhane柞蚕蛹蘸坏蛹液杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂0.0478875*0.0364625-0.2874375*-0.0013750-0.9299375*-0.1524750-0.0917000*-0.2324000 0.0088102 0.0087872 0.0702960 0.0293594 0.0085154 0.0426028 0.0157496 0.0513678 0.022 0.112 0.021 1.000 0.000 0.248 0.003 0.082用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液0.2802875*0.2688625*-0.0550375 0.2310250-0.6975375*0.0799250 0.1407000 0.2324000 0.0507074 0.0507035 0.0862273 0.0579276 0.0506571 0.0656401 0.0523610 0.0513678 0.031 0.039 1.000 0.075 0.000 1.000 0.637 0.082杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂-0.0114250*-0.3353250*-0.0492625-0.9778250*-0.2003625*-0.1395875*-0.0478875*-0.2802875*0.0031319 0.0698149 0.0281881 0.0022597 0.0418043 0.0134404 0.0088102 0.0507074 0.046 0.004 0.869 0.000 0.039 0.000 0.014 0.018 Dunnett T3不用杀菌灯照射不接蜂封箱杀菌灯照射后不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂0.0114250*-0.3239000*-0.0378375-0.9664000*-0.1889375-0.1281625*-0.0364625-0.2688625*0.0031319 0.0698120 0.0281810 0.0021685 0.0417994 0.0134254 0.0087872 0.0507035 0.046 0.006 0.980 0.000 0.052 0.000 0.067 0.023

比较方法(I)处理方式 (J)处理方式 均值差(I-J) 标准误 显著性封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂0.3353250*0.3239000*0.2860625*-0.6425000*0.1349625 0.1957375 0.2874375*0.0550375 0.0492625 0.0378375-0.2860625*-0.9285625*-0.1511000-0.0903250 0.0013750-0.2310250 0.9778250*0.9664000*0.6425000*0.9285625*0.7774625*0.8382375*0.9299375*0.6975375*0.0698149 0.0698120 0.0752229 0.0697783 0.0813111 0.0710250 0.0702960 0.0862273 0.0281881 0.0281810 0.0752229 0.0280974 0.0503185 0.0310645 0.0293594 0.0579276 0.0022597 0.0021685 0.0697783 0.0280974 0.0417431 0.0132491 0.0085154 0.0506571 0.004 0.006 0.028 0.000 0.948 0.285 0.019 1.000 0.869 0.980 0.028 0.000 0.227 0.283 1.000 0.053 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Dunnett T3注射小蜂浸泡离心液杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂0.2003625*0.1889375-0.1349625 0.1511000-0.7774625*0.0607750 0.1524750-0.0799250 0.0418043 0.0417994 0.0813111 0.0503185 0.0417431 0.0437953 0.0426028 0.0656401 0.039 0.052 0.948 0.227 0.000 0.977 0.142 0.997注射蒸馏水柞蚕蛹蘸坏蛹液杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液柞蚕蛹蘸坏蛹液用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂杀菌灯照射后不接蜂封箱不用杀菌灯照射不接蜂封箱封闭木箱接蜂用干净针头扎用蘸过坏蛹液针头扎注射小蜂浸泡离心液注射蒸馏水用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂0.1395875*0.1281625*-0.1957375 0.0903250-0.8382375*-0.0607750 0.0917000*-0.1407000 0.0478875*0.0364625-0.2874375*-0.0013750-0.9299375*-0.1524750-0.0917000*-0.2324000*0.0134404 0.0134254 0.0710250 0.0310645 0.0132491 0.0437953 0.0157496 0.0523610 0.0088102 0.0087872 0.0702960 0.0293594 0.0085154 0.0426028 0.0157496 0.0513678 0.000 0.000 0.285 0.283 0.000 0.977 0.003 0.397 0.014 0.067 0.019 1.000 0.000 0.142 0.003 0.048

注*.均值差的显著性水平为0.05。

2.2.2 “用干净针头扎”与“用蘸过坏蛹液针头扎”坏蛹率有明显差异，表明非带毒物体刺穿并不能导致坏蛹显著增多；而带毒物体刺穿柞蚕蛹体可传播坏蛹病原菌。

2.2.3 “注射小蜂浸泡离心液”坏蛹率与“用蘸过坏蛹液针头扎”有显著差异，而与“杀菌灯照射后不接蜂封箱”、“不用杀菌灯照射不接蜂封箱”均无显著差异，表明通过浸泡小蜂及掰开的种蛹并离心得到的液体，可能坏蛹病原菌浓度不够，或根本不带病原菌，无法通过本试验断定小蜂成蜂及寄生过的种蛹是否带有坏蛹病原菌。如要得到确定结论，应当对离心后的浸泡液进行分离再培养研究。

2.2.4 “用坏蛹相处1 h的小蜂接蜂”坏蛹率显著高于“杀菌灯照射后不接蜂封箱”、“不用杀菌灯照射不接蜂封箱”，而与“封闭木箱接蜂”、“注射小蜂浸泡离心液”无显著差异，表明小蜂高强度接触而使小蜂产卵器带毒从而增加了坏蛹率，相当于正常木箱接蜂的水平。

3 结论与讨论

3.1 虽然经过人工分拣，但仍有2%-3%柞蚕蛹携带坏蛹病菌。由于小蜂产卵前有用产卵器探查的习性，雌成蜂在刺穿病蛹表皮、未产卵但携带坏蛹病菌，在健康柞蚕蛹上产卵过程中将坏蛹病菌传播到健康蚕蛹，从而导致坏蛹数量增加。因此，小蜂产卵是周氏啮小蜂繁育过程中导致坏蛹的主要途径，小蜂种蜂产卵接蜂的过程，也是坏蛹病菌的传播过程。白蛾周氏啮小蜂成为坏蛹病原菌传播的媒介。坏蛹病原菌不能通过空气传播，也不能通过接触传播。

3.2 降低坏蛹率的关键措施是注意在繁育接蜂过程中对白蛾周氏啮小蜂雌成蜂及其产卵器进行消毒。