微创可注射双相骨水泥的制备及性能表征和复合DBM成骨能力研究*

张铁 祝超 叶莹 雷军 代春初 胡丽 司旭 张旗* 闫飞飞 蔡林

在全球范围内，骨移植是仅次于输血的第二大组织移植。目前，用于治疗骨缺损的3 种材料主要是自体骨、同种异体骨以及人工骨[1-6]。其中，自体骨始终作为骨移植的“金标准”，治疗效果最好，但是手术过程较为复杂，需要从患者身体取骨，导致术后疼痛和并发症[1-5]。同种异体骨，如脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBM），其天然微孔结构有利于传导成骨，同时富含活性成骨因子而具有诱导成骨能力，能够促进成骨细胞生长，但是材料来源单一，产品易漂移、不方便手术操作和植入部位的维持，且单独的DBM不能用于微创注射[1-3,7]。所以相对于自体骨和同种异体骨，人工骨具有来源广泛、产品多样化的优势。其中，骨水泥产品由于其良好的加工性能，能原位固化而被广泛研究和应用。

硫酸钙作为一种传统的骨修复材料，因具有良好的生物相容性和骨传导性而被广泛研究，且在临床上取得较优异的成果[8-12]。但是，硫酸钙骨水泥同时也存在可注射时间较短、降解时间过快、缺乏骨诱导活性等缺点，导致植骨区未愈合时材料已经完全降解。磷酸钙具有良好的生物活性、生物相容性和可注射性，能够提供人体成骨所需的钙离子和磷酸根离子；但是磷酸钙类骨水泥可降解性能差，阻碍骨组织的生长[13-16]。单一材料制备的人工骨由于自身材料的缺陷，往往难以满足多方面的要求。所以，选用两种或者两种以上材料，综合各材料的优势，避免材料的缺点，共同达到临床上各方面的要求就显得尤为重要。

由此，本研究项目将硫酸钙、磷酸钙和羟丙甲纤维素（hypromellose，HPMC）作为固相原料，磷酸盐溶液为液相，制备了一种双相骨水泥，该骨水泥避免了硫酸钙降解过快和磷酸钙降解过慢的缺点，可与DBM 粉调和为可注射型植骨材料，解决了DBM 粉的植入操作性问题，同时DBM 的良好的诱导成骨能力促进了骨水泥的成骨效果。本文对该骨水泥的降解性能、力学性能、抗溃散性能及微观结构进行了研究，并与DBM 复配使用，评估其成骨性能。

1 材料与方法

1.1 双相骨水泥的制备

骨水泥由固相和液相组成，固相为硫酸钙、磷酸钙及羟丙甲纤维素（HPMC）为主的混合粉末，液相为磷酸盐溶液。

固相制备：将硫酸钙（医药级，湖南尔康制药股份有限公司）、磷酸钙（医药级，昆山华侨新材料科技有限公司）及HPMC（医药级，浙江中维药业股份有限公司）通过球磨机在（350±10）r/min的条件下球磨，球磨时间10 ～30 min。

1.2 脱钙骨基质（DBM）的制备

选用200 ～300 g 雄性SD 大鼠50 只（武汉大学动物实验中心提供），麻醉处死后取长管骨段压碎后用手工磨粉器将其制作成骨粉，用分析筛筛选100 ～900 m 的骨粉备用。在10℃～12℃条件下，用乙醇复合溶剂进行脱脂，磁力搅拌24 h，用纯化水进行反复震荡冲洗40 min。用0.6 mol/L的盐酸对骨粉进行脱钙，磁力搅拌器持续搅拌24 h，更换盐酸溶液后再脱钙24 h。用纯化水反复冲洗骨粉1 h。将所有骨粉同时进行冷冻干燥24 h。本实验得到武汉大学中南医院动物伦理委员会的批准。

1.3 可注射时间、可注射性能和抗溃散性能

1.3.1 可注射时间

可注射时间能够有效评价骨水泥是否方便于临床操作。在温度为（27±2）℃的环境下，将2.0 g 固相与0.8 mL 液相混合后转移到2.5 mL 的注射器中，推挤出前段空气，并塞紧锥头帽。以开始混合为初始时间，20 min 后将锥头帽取下，将注射器安装到万能材料试验机上，垂直固定，锥头向下，以30 mm/min 的推动速度测量推挤出来所需要的压力（推挤力），运行时间为25 ～30 s。若推挤力大于100 N，则可注射时间小于20 min；若推挤力小于100 N，则可注射时间大于20 min。实验重复3 次。

1.3.2 可注射性能

在温度为（27±2）℃的环境下，将2.0 g 固相与0.8 mL液相混合后转移到2.5 mL 的注射器中，推挤出前段空气，将注射器安装到万能材料试验机上，垂直固定，锥头向下，加载100 N 恒定压力，以10 mm/min 的推动速度向下挤出骨水泥，骨水泥的总重量为M，挤出后，剩余骨水泥的重量为M1，利用公式（1）计算双相骨水泥的可注射性，重复5 次，计算算术平均值和标准差。

1.3.3 抗溃散性能

将装有生理盐水的培养皿中放入恒温恒湿箱中，调节参数：温度37℃，湿度＞90%，待参数稳定半小时后，将刚混合好的骨水泥转移到2.5 mL 的注射器中，注射到培养皿中，观察0 h 和24 h 的形态，重复3 次。

1.4 双相骨水泥体外降解性能及理化性能

将双相骨水泥混合成泥状，放入到模具（内孔=6 mm，h=12 mm）中成型，然后转移到恒温恒湿箱（温度37℃，湿度98%）中固化12 h，固化后将样品取出，在烘箱（50℃）中干燥，直至样品间隔0.5 h 称量质量差小于1%，记录质量，然后分别将样品放到5 mL 的生理盐水中，将所有样品放置到37℃环境中，样品分别放置3 d、5 d、14 d、28 d、56 d 后取样，每次取6 个样品进行观察。每周更换生理盐水，样品从生理盐水中取出后，烘干，测量其质量后，利用万能材料试验机（Instron 5967，中国）测量抗压强度，探头加载速度为0.5 mm/min，并通过扫描电子显微镜（JSMIT300，日本）和X 射线衍射仪（D8 Advance，中国）对破损样品分别进行截面分析和物相分析。

1.5 成骨性能预评估

本试验仅用于初期评估双相骨水泥与DBM复配使用的成骨性能。

1.5.1 动物模型的制作与分组

双相骨水泥和DBM 经Co60 灭菌（16 ～20 kGy），通过搅拌工具将骨水泥与40wt%DBM 混合，转移到模具中（内孔=6 mm，h=1.5 mm）成型后用。

健康8 周雄性Sprague-Dawly 大鼠12 只（武汉大学动物实验中心提供），体重160 ～200 g。实验组：手术前进行腹腔麻醉，大鼠头部剃毛后常规消毒铺巾，在无菌条件下切开皮肤，切口长约1.5 cm，使用磨骨钻造孔（ 6 mm），植入样本材料，缝合筋膜皮肤，放回笼内分开养殖，动物苏醒后自由活动，正常喂食。术后6 周、8 周和15 周处死动物，每次3 只，取植入物及其周围的骨组织。空白组：造孔后不植入材料，其他步骤相同，术后6 周处死观察。

CS/TCP 组：健康8 周雄性Sprague-Dawly 大鼠5 只（武汉大学动物实验中心提供），体重160 ～200 g。造孔后植入双相骨水泥，其他步骤相同，术后12 周处死观察。相关数据由武汉大学中南医院提供。

1.5.2 组织形态学观察

标本经10%福尔马林固定后，常规脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片，常规行HE 染色，观察组织学变化。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件处理数据，抗压强度和降解质量比以均数±标准差表示。抗压强度比较采用 检验＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 可注射时间、可注射性能和抗溃散性能

该双相骨水泥可注射时间＞20 min；固相与液相混合转移到注射器中后立即注射，或20 min后，可注射性能均＞90%，除了部分残留在锥头中的骨水泥无法注射干净，其他全部挤出，具有理想的可注射性能。与脱钙骨基质（DBM）复配使用后，能够达到同样的效果。

图1 为骨水泥注射到生理盐水中的形貌，从图中看出，注射出的骨水泥表面光滑，形态均匀，无论是否添加DBM，该双相骨水泥都能够保持原状，未发生溃散。且两者注入到生理盐水中60 min 后轻微振荡，材料形态均未发生变化。

图1 骨水泥注射到生理盐水中的形貌：A.双相骨水泥，0 h;B.双相骨水泥，24 h;C.双相骨水泥/DBM，0 h;D.双相骨水泥/DBM，24 h

2.2 体外降解性能及理化性能

图2 是双相骨水泥在生理盐水中抗压强度和质量随时间的变化，具体数据陈列在表1 中，从图2 和表1 中可以看出，随着浸泡时间的延长，骨水泥呈下降趋势，逐渐降解，但是抗压强度先增加后减小，第5d 达到最大，为（21.4±3.1）MPa，56 d 时为（9.7±2.2）MPa。图3 为双相骨水泥在生理盐水浸泡不同时间后的SEM 分析，从图中看出，浸泡3 d 时，骨水泥空隙较少，随着浸泡时间的延长，骨水泥的孔隙逐渐增加，在56 d 时，能够观察到分布均匀的空隙，空隙尺寸为0 ～150 m。图4 为双相骨水泥在生理盐水浸泡不同时间后的XRD 分析，浸泡3 d 后，能够明显观察到二水硫酸钙、半水硫酸钙（calcium sulfate hemihydrate, CSH）和缺钙型羟基磷灰石（calcium deficient hydroxyapatite, CDHA）的特征峰，随着浸泡时间的延长，CSH 的特征峰强度逐渐减弱，在56 d 时完全消失，且二水硫酸钙的特征峰强度在56 d 时明显降低，CDHA 的特征峰强度整个过程无明显变化。

图2 双相骨水泥在生理盐水中抗压强度和质量随时间的变化

表1 双相骨水泥在生理盐水中浸泡不同时间的抗压强度和质量比

图3 双相骨水泥在生理盐水浸泡不同时间后的SEM 分析（×200）：A.3 d;B.14 d;C.28 d;D.56 d

图4 双相骨水泥在生理盐水浸泡不同时间后的XRD 分析

2.3 植入试验

2.3.1 大体观察

SD 大鼠均无死亡，活动、进食情况正常，精神状态无明显变化。未见瘫痪、惊厥、呼吸抑制等不良反应。伤口均愈合良好。实验组：取材后，6 周材料降解明显，形态发生明显改变，与周围骨组织融合，但材料硬度较低；8 周时，材料变硬，颜色加深，难以与周围骨组织区分；15 周时，植骨区域与周围骨组织无区别。空白组：骨缺损区域未见明显减小，无明显成骨。CS/TCP 组：骨缺损区域减小，无明显材料剩余。

2.3.2 组织形态学观察

HE 染色观察植入双相骨水泥/DBM 在不同时期的演变过程：术后6 周，无大片连续空白区域，表明骨水泥降解明显，大量红细胞和血管长入，存在形态完整的DBM 颗粒，且转化为新骨，可见大量骨细胞，新骨被成骨细胞及间充质细胞包绕，骨缺损中间和边缘都可见明显成骨（见图5B）。术后8 周，空白区域进一步减少，表明材料被进一步吸收，成骨区域明显增加，可见明显骨髓，整个植骨区域基本被新骨和纤维组织替代（见图5C）。术后15 周，成骨区域连成一片，与周围骨组织完全连接，骨修复基本完成（见图5D）。整个过程材料降解速度与成骨基本一致，成骨迅速，15 周骨修复基本完成。术后6 周，空白组骨缺损区域无明显成骨，边缘有少量新骨生成（见图5A）。术后12 周，CS/TCP 组成骨区域仅限骨缺损边缘区域，中间区域未见明显成骨（见图5E）。

图5 SD 大鼠颅骨植入试验HE 染色切片（×20）：A.空白组（术后6 周）;B.实验组（术后6 周）;C.实验组（术后8 周）;D.实验组（术后15 周）;E.CS/TCP 组（术后12 周）

3 讨论

骨水泥相对于其他植骨材料，主要优势在于能够微创注射，减轻患者痛苦。可注射时间和可注射性能能够有效表明该产品能否用于微创注射，可注射时间太短，产品易凝固在注射工具中，给患者带来额外的伤害，可注射性能太差，产品残留在注射工具中过多，增加患者费用。该双相骨水泥混合均匀后即具有良好的注射性能，可注射时间＞20 min，可注射性能＞90%，且在1 h 内具有一定程度的固化，能够用于微创注射。

由于植骨区域存在一定的组织液，若产品的抗溃散性能较差，产品会流失到其他部位，不利于骨组织的愈合。该双相骨水泥初期主要通过羟丙甲纤维素良好的黏性起到抗溃散的作用，后期骨水泥发生固化，形成整体，从而达到长时间不溃散的效果。

CSH 在生理盐水中由于水化过程会转变为CSD，同时也会缓慢溶解，所以观察到CSH 特征峰强度逐渐减弱，直至消失，而磷酸钙水化后会生成羟基磷灰石。由于水化作用的存在，材料会逐渐形成只含有CSD 和CDHA 的双相结构，同时骨水泥的抗压强度也会逐渐升高，但是由于硫酸钙在不断降解，形成孔隙，而水化过程逐渐减弱，最后骨水泥的抗压强度逐渐降低。从SEM 分析可以看出，骨水泥的孔隙在不断增加，最后形成多孔结构。由于硫酸钙降解较CDHA快，当硫酸钙完全降解后，骨水泥会形成只含有CDHA 的多孔结构。在体内，多孔结构的存在，有利于细胞的长入，起到骨传导的作用。同时，在体内细胞的吞噬作用会加速CDHA 的降解，释放的钙离子和磷酸根离子有利于骨愈合，使其逐渐被骨组织替代。

硫酸钙和磷酸钙植骨材料都具有良好的生物相容性，植入体内后都能够被人体吸收，逐渐被骨组织替代[3-6]。硫酸钙在降解的过程中释放大量的钙离子，同时形成微酸环境，具有一定去矿化作用，促进周围骨组织释放BMP 等生长因子[8-11]；磷酸钙降解过程中会释放钙离子和磷酸根离子，有助于类骨质的钙化，形成新骨。双相骨水泥/DBM 植入体内后，硫酸钙会优先降解，促使材料形成多孔结构，有助于细胞的长入，促进内部DBM 的降解。由于硫酸钙6 ～8 周完全降解，而磷酸钙降解较少，所以术后6 周，可明显观察到空白区域。同时观察到DBM 降解，从而释放BMP 等生长因子，诱导间充质细胞向成骨细胞转化，所以双相骨水泥/DBM 不仅具有骨传导能力还有骨诱导能力，故而观察到骨缺损的边缘与中间区域同时成骨，加速骨愈合。术后8 周，成骨区域增加明显。同时磷酸钙降解较慢，能够起到骨传导和促进类骨质钙化的作用，持续促进成骨，术后15 周骨缺损基本愈合，仅少量磷酸钙盐未降解，可以观察到小部分空白区域，后期可被骨组织完全替代。由于单独的双相骨水泥仅具有骨传导能力，故而仅观察到新骨沿边缘逐渐向内生长，中间区域没有新骨形成，不能多区域同时成骨，从而不能多区域发生骨传导作用，故而骨形成速度较双相骨水泥/DBM 慢。

4 结论

本研究制备的双相骨水泥具有良好的注射性能及降解性能，在生理盐水中具有较好的抗溃散性能，长时间维持一定的力学强度。完全固化后会形成双相结构，使其在降解的过程中形成多孔结构，加速剩余材料的降解。与DBM 复配使用后，同样具有较好的注射性能和抗溃散性能，是DBM 实现微创注射的良好载体，植入SD 大鼠体内，其降解速度与成骨速度基本一致，能够快速成骨，术后15 周骨愈合基本完成，但还能观察到少量磷酸钙材料未降解。本文主要缺点在于动物数量较少，观察指标较少，有待进一步研究。