脑心通胶囊对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合的作用*

宋 敏 ，陈 璐 ，李春晓 ，房志锐 ，张璐莎 ，Joel Wake Coffie，张丽媛 ，马璐璐，王 虹

（1.方剂学教育部重点实验室，天津市中药药理学重点实验室，天津中医药大学中医药研究院，天津 301617；2.天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617）

糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病的并发症之一，在世界范围内发病率很高，近年来，世界上有近30%的人口患有糖尿病，其中650万人患有慢性皮肤溃疡[1]。DFU的发病机制复杂，其中由糖尿病引起的缓慢的伤口愈合是糖尿病坏疽的主要原因[2]。在过去的几十年中，在预防DFU患者的发病率和治疗方面几乎没有取得突破，此外，目前用于DFU的治疗药物大多是生长因子，这使得治疗成本增加。因此，对于DFU的预防和治疗，迫切需要更有效、更特异的药物[3]。脑心通胶囊（NaoXinTong，NXT）是含有11种中草药，2种树脂药和3种动物药的精粉混合物[4]。现代药理学的研究表明，NXT能通过抑制小鼠树突状细胞的成熟、巨噬细胞一氧化氮吸入（iNO）和一氧化氮（NO）的生成来减少动脉粥样硬化[5-8]。而且脑心通能改善糖尿病小鼠的糖/脂代谢、维持组织结构完整性、降低糖尿病引起的肾功能障碍来抑制糖尿病肾病[9]。课题组前期研究研究结果显示NXT能促进心肌缺血小鼠心功能恢复，减小心肌梗死面积，其机制与促进心肌缺血边缘区血管新生有关[10]。但NXT是否可以促进糖尿病小鼠伤口愈合及血管新生不清楚，本研究采用db/db小鼠切除伤口夹板模型探讨了NXT对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合的作用及其可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物 8～12周SPF级雄性C57BL/6JNju（db/+）和 BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/JNju（db/db）小鼠由南京大学南京生物医学研究所提供。小鼠体内实验方案由天津中医药大学伦理委员会批准。小鼠在中国医学科学院放射医学动物研究所（天津）于温度22～25℃和相对湿度50%～60%条件下饲养。

1.2 药物 脑心通超微粉末由陕西步长制药有限公司提供，由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、制乳香、制没药、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、全蝎、水蛭组成。将脑心通超微粉末加入生理盐水中配制成0.07 g/mL溶液，分装备用。

1.3 试剂 avertin（美国 Sigma公司）；RIPA（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂和 PMSF（瑞典巴塞尔罗氏集团）；β-actin、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT（美国 Cell Signaling Technology有限公司）；其他抗体，包括VEGF，eNOS/p-eNOS（上海Abcam有限公司）；血糖仪和血糖试纸（瑞典巴塞尔罗氏集团）；甲醇等其他常用试剂为国产分析纯，实验用水为去离子水。

2 方法

2.1 造模 小鼠腹腔注射Avertin（16.5 mL/kg），在麻醉下从背部表面去除毛发后，在小鼠中线上创建一个6 mm的全层切除皮肤伤口。用粘合剂硅胶板固定在伤口周围，并用5-0缝合线缝合。在伤口上滴下庆大霉素后，用无菌透明敷料覆盖伤口，每2日更换1次。

2.2 分组及给药 将db/db和db/+小鼠按体重随机分为 3组：db/+Saline组、db/db Saline组、db/db NXT组[脑心通0.7 g/（kg·d）]。给药组给予相应的脑心通药液，模型组给予等量的生理盐水，每天灌胃给药1次，连续给药17 d。

2.3 伤口愈合分析 用照相机对伤口闭合区进行追踪，每2天追踪1次。用Image J软件对创面闭合度进行量化，以创面愈合面积百分比表示，计算为：[1-（day X创面面积/day 0天创面面积）]×100%。

2.4 HE染色 创面皮肤组织用4%聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（5μm）。石蜡切片加热60℃过夜，然后通过二甲苯和一系列分级乙醇溶液脱蜡。然后进行苏木精染色，盐酸分化，流水冲洗后酒精脱水，伊红溶液染色。最后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。HE染色后，体式显微镜拍片，用Image J计算肉芽组织面积和上皮化程度。

2.5 免疫荧光评价 小鼠在处死前30 min静脉注射50μL的Griffonia Simpli-cifolia Lectin I（1mLHKS缓冲液稀释）。创面皮肤组织用4%聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（5μm）。石蜡切片加热60℃过夜，然后通过二甲苯和一系列分级乙醇溶液脱蜡。切片用预热抗原修复液孵育10 min，在PBS中洗涤3次后，用5%胎牛血清在PBS中室温下封闭1 h。将一抗ANTI-SOYBEANAGGLUTININ（PBS缓冲液稀释1∶100）与切片在4℃下隔夜孵育，二抗DyLight®594 ANTI-GOATIgG（H+L）（PBS 缓冲液稀释 1∶200）在室温黑暗环境中孵育20 min。用抗荧光衰退淬灭剂封片，在倒置荧光显微镜下观察。

2.6 Western blotting 将组织放入预冷的裂解液中（10 mL裂解液：10 mL RIPA+0.1 g蛋白酶抑制剂+0.1 g磷酸酶抑制剂+50μL PMSF），研磨破碎，4℃离心，12 000 r/min共15 min，吸取上层上清液，BCA法测定蛋白浓度，定量。在10%SDS-PAGE上分离每个样品，并将其转移到PVDF膜上。在TBST中用5%牛血清白蛋白或脱脂牛奶（TBS中用0.1%Tween-20）封闭3 h后，在4℃下与各自的一抗孵育过夜，后用TBST彻底洗涤。然后，将膜与二抗辣根过氧化物酶（1∶10 000）在室温下孵育1 h。用增强的化学发光检测试剂进行印迹检测。用Image J量化蛋白条带的灰度强度，并与每个样品中的β-actin进行归一化。

2.7 统计分析 统计分析使用SPSS软件进行。实验的结果用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 脑心通胶囊对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合的影响 术后给药16 d后，与正常小鼠的伤口愈合相比，糖尿病模型组小鼠在组织损伤后的伤口愈合速率明显降低（P＜0.05或 P＜0.01），在糖尿病小鼠中，脑心通组与模型组相比较，损伤后10～14 d伤口愈合率脑心通组明显高于模型组（P＜0.05），说明脑心通能明显促进糖尿病小鼠的伤口愈合速率，见图1。

3.2 脑心通胶囊对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口边缘肉芽组织的形成和上皮化的影响 术后7，16 d，HE免疫组化染色，观察伤口边缘组织形态。如图2所示：在术后7 d，3组小鼠都处于伤口愈合期，伤口边缘组织中能观察到明显的肉芽组织和上皮化，与db/+Saline小鼠相比，db/db Saline小鼠伤口组织边缘肉芽组织面积和上皮化程度明显降低，而与db/db Saline相比，db/db NXT组小鼠伤口边缘上皮化明显增加，肉芽组织的面积无明显变化。术后16 d，db/+Saline小鼠伤口完全愈合，伤口组织边缘肉芽组织和上皮化退化，角质层形成，与db/+Saline小鼠相比，db/db Saline小鼠伤口组织边缘肉芽组织和上皮化明显，而在db/db小鼠中，伤口仍处于愈合阶段，伤口组织边缘能观察到明显的肉芽组织和上皮化，但与db/db Saline相比，db/db NXT组小鼠伤口边缘肉芽组织的面积增加和上皮化降低。

3.3 脑心通对糖尿病小鼠的体质量、空腹血糖的影响 如图3所示，与db/+相比较，db/db小鼠的体质量和血糖均高于db/+小鼠，而脑心通给药组与db/db模型组相比，体质量和血糖均没有明显变化。

3.4 脑心通对伤口边缘血管密度和VEGF的表达的影响 如图4～6所示，与正常的小鼠相比，db/db Saline组伤口周围的血管密度和毛细血管密度明显降低（P＜0.01），而 db/db NXT组与 db/db Saline组相比，伤口周围的血管密度和毛细血管密度也明显增加（P＜0.05），Western blotting的结果显示，与正常组小鼠相比，在组织损伤7 d时，db/db Saline组VEGF表达量明显降低，而db/db NXT组与db/db Saline组相比，VEGF的表达量明显增加。

3.5 脑心通对PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响在图7中，与正常小鼠相比，db/db Saline组的PI3K磷酸化明显降低（P＜0.05），而db/db NXT组与db/db Saline相比PI3K、AKT和eNOS磷酸化明显增加（#P＜0.05 and##P＜0.01），说明脑心通能促进 PI3K、AKT和eNOS的磷酸化，从而激活PI3K/AKT/eNOS信号通路。

图1 脑心通对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合的影响

图2 脑心通对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口处肉芽组织形成和上皮化的影响

图3 脑心通Ⅱ型糖尿病小鼠体质量、空腹血糖的影响

4 讨论

图4 脑心通对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口边缘血管密度的影响（n＝6）

图5 脑心通对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口边缘毛细血管的影响

图6 脑心通对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口周围组织VEGF表达的影响

图7 脑心通对PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

糖尿病伤口愈合迟缓或者不愈合是导致DFU的主要原因[2]。目前，临床上用于治疗糖尿病伤口愈合的方法主要有加强伤口护理，降低局部压力，改善微循环和控制炎症反应等，但在临床应用中只能达到很低的愈合率。近年来干细胞技术、生长因子治疗、氧疗等虽然应用于实验室和临床，但仍存在治疗效果短暂和成本较高等弊端[11]。因此，对于DFU的治疗，需要更有效、更特异的药物。NXT是在经方补阳还五汤的基础上加入乳香、没药、丹参、鸡血藤增加其活血化瘀作用，临床上主要用来治疗缺血性心脑血管疾病。在本研究中，我们使用Ⅱ型糖尿病小鼠，建立切除性创面夹板模型，该模型将夹板紧密地贴附在创面周围的皮肤上，通过减少由于皮肤收缩和创面敷料引起的变化，实现创面均匀闭合，使伤口愈合的过程更接近于Ⅱ型糖尿病人伤口愈合的过程[12]。笔者研究结果显示NXT可以促进Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合，提示NXT可以用于治疗糖尿病并发症。

组织损伤时释放出多种损伤相关分子，引发急性促炎反应，导致各种促炎介质（如细胞因子和趋化因子）的释放，这些介质诱导炎症细胞募集，分泌细胞因子、生长因子等促进细胞外基质的降解，以及各种细胞，主要是成纤维纤维细胞的增殖和迁移，形成肉芽组织，最后肉芽组织变薄，细胞外基质的聚集和沉积形成瘢痕[13-16]。在肉芽组织的形成过程中，细胞的增殖和迁移所需的氧气和营养物质需要血管的运输，因此血管新生在肉芽组织的形成过程中发挥了很大的作用。但是在糖尿病患者中，高糖环境和持续的炎症反应使内皮细胞的数量减少，其增殖、迁移、黏附、血管新生的能力减弱，微血管损伤，血管新生受损，伤口愈合推迟[17]。笔者以前的研究表明，NXT能减小急性心肌梗死小鼠心肌梗死面积，促进心功能恢复，其机制与促进缺血组织血管新生有[18]。本研究采用Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合模型进一证实NXT可以促进损伤组织血管新生及肉芽组织形成，加速伤口愈合。

伤口愈合中的血管新生依赖于促血管生长因子的作用，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最强的促进血管新生因子，VEGF与其受体结合后可促进内皮细胞增殖迁移，从而促进血管新生，但是在糖尿病环境下，VEGF的表达下调，内皮细胞增殖和粘附的能力减弱，血管新生受到抑制[19-20]。PI3K/AKT/eNOS信号通路是激活酪氨酸激酶信号通路，当VEGF与内皮细胞表面受体的结合能激活细胞内酪氨酸激酶，触发多种促进血管生成的下游信号，大量的证据表明PI3K/AKT/eNOS相关的信号通路参与内皮细胞的存活与增殖，从而促进血管新，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的磷酸化能刺激诱导下游蛋白丝氨酸苏氨酸激酶（AKT）的磷酸化，磷酸化的AKT导致其下游一氧化氮合酶 （eNOS）底物的激活，从而促进NO的产生，NO是维持内皮细胞生物学功能的基本分子[10，21]。笔者结果表明脑心通能促进PI3K、AKT和eNOS磷酸化，从而激活PI3K/AKT/eNOS信号通路，增加VEGF的表达，促进血管新生和伤口愈合。笔者以前的研究显示脑心通能激活VEGF/eNOS信号通路增加缺血区毛细血管密度促进心肌缺血小鼠心功能恢复[21]。本研究结果显示在伤口愈合的过程中脑心通能激活PI3K/AKT/eNOS信号通路，增加VEGF的表达，促进血管新生从而促进肉芽组织的形成，加速Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合。

综上所述，脑心通胶囊能促进Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合，其作用机制与激活PI3K/AKT/eNOS信号通路、上调VEGF的表达从而促进组织血管新生有关。本研究为NXT应用于糖尿病并发症的治疗提供了实验依据。然而NXT成分复杂，其促进Ⅱ型糖尿病伤口愈合多靶点作用机制还有待进一步探讨。