氯化两面针碱体外对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响

董涛　吴倩

[摘要] 目的 研究氯化两面针碱体外对人喉癌细胞株Hep-2增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。 方法 体外培养Hep-2细胞，以5、10、20、40、60、80 μmol/L的氯化两面针碱作用细胞，MTT法检测不同时间和不同浓度的氯化两面针碱对细胞生长的抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测10、20、40 μmol/L的氯化两面针碱对细胞凋亡的影响;Transwell小室法检测5、10 μmol/L的氯化两面针碱对细胞的侵袭和迁移能力的影响。 结果 在5、10、20、40、60、80 μmol/L浓度范围内，氯化两面针碱对Hep-2细胞的生长抑制率随着时间的延长逐渐升高，明显高于对照组同一时间点细胞（P < 0.05）;在10、20、40 μmol/L范围内，氯化两面针碱诱导Hep-2细胞凋亡率逐渐增多，与细胞对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;与10 μmol/L氯化两面针碱组比较，20、40 μmol/L氯化两面针碱组Hep-2细胞凋亡率明显升高，差異有统计学意义（P < 0.05）。与细胞对照组比较，5、10 μmol/L的氯化两面针碱可显著降低Hep-2细胞侵袭和迁移细胞数（P < 0.05）;与5 μmol/L氯化两面针碱组比较，10 μmol/L氯化两面针碱组降低得更多（P < 0.05）。 结论 氯化两面针碱可抑制人喉癌细胞株Hep-2细胞的生长，该抑制作用与诱导其凋亡及降低其侵袭和迁移能力有关。

[关键词] 氯化两面针碱;Hep-2;增殖;凋亡;侵袭;迁移

[中图分类号] R739.65          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（a）-0017-05

Effect of nitidine chloride on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration in laryngeal carcinoma cell line Hep-2 in vitro

DONG Tao1   WU Qian2

1.Department of Pharmacy， Beijing Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing   100039， China; 2.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Science  Xiangyang Central Hospital， Hubei Province， Xiangyang   441021， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nitidine chloride on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration in laryngeal carcinoma cell Hep-2 in vitro. Methods Hep-2 cells were cultured by nitidine chloride with 5， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L in vitro， and MTT was performed to observe the proliferation at different times. Annexin V-FITC/PI flow cytometry was used to determine the apoptosis rate by nitidine chloride with 10， 20， 40 μmol/L. Transwell method was used to detect the invasion and migration by nitidine chloride with 5， 10 μmol/L. Results At concent of 5， 10， 20， 40， 60， 80 μmol/L， the growth inhibition rate of nitidine chloride on Hep-2 cells increased gradually with the increase of time， compared with the control group at the same time point （P < 0.05）. At concent of 10， 20， 40 μmol/L， the apoptosis rate of Hep-2 cells induced by nitidine chloride gradually increased， compared with the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; compared with the nitidine chloride with 10 μmol/L， the nitidine chloride with 20， 40 μmol/L increased the apoptosis rate， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared to the control group， nitidine chloride with 5， 10 μmol/L reduced the number of cells of invasion and migration of Hep-2 cells significantly （P < 0.05）; compared with the nitidine chloride with 5 μmol/L， nitidine chloride with 10 μmol/L decreased the number more significantly （P < 0.05）. Conclusion Nitidine chloride could inhibit the proliferation of Hep-2 cells， the mechanism is related to the induction of apoptosis and the inhibition of invasion and migration.

2.3 对Hep-2细胞体外侵袭能力的影响

5、10 μmol/L氯化两面针碱组Hep-2细胞侵袭数与细胞对照组比较均显著降低（P < 0.01），提示这两个浓度的氯化两面针碱体外可抑制Hep-2细胞的侵袭能力，该抑制能力随浓度增加而增强，与5 μmol/L氯化两面针碱组比较，10 μmol/L氯化两面针碱组侵袭细胞数显著减少（P < 0.05）。见表2。

2.4 对Hep-2细胞体外迁移能力的影响

5、10 μmol/L的氯化两面针碱组迁移细胞数与细胞对照组比较均显著降低（P < 0.01），浓度越大迁移细胞数越少，提示氯化两面针碱能浓度依赖性地抑制Hep-2细胞的体外迁移，与5 μmol/L氯化两面针碱组比较，10 μmol/L氯化两面针碱组迁移细胞数显著减少（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

喉癌是发生于上呼吸道的头颈部恶性肿瘤，93%～99%的病理分型为喉鳞状细胞癌，发生率占世界范围内每年新发恶性肿瘤病例的2.4%[6]。常规治疗喉癌的方法预后并不理想，局部复发和远处转移是头颈部肿瘤影响疗效和生存率的重要原因[7]。所以，既能有效抑制肿瘤生长，又可降低其转移复发能力的新的治疗方法是众多学者极力寻找的。而氯化两面针碱由于具有良好的抗癌作用，已逐渐成为抗癌药物中的热门研究对象。

细胞凋亡是机体自发启动的维持内环境稳定的一种重要调节机制，当凋亡失去控制就会引起细胞无限增殖[8]。肿瘤也称作细胞增殖周期紊乱性疾病，其区别于其他疾病最明显的特征就是细胞不受机体正常调节而无限制地生长和繁殖。研究表明很多中药可通过各种机制诱导肿瘤细胞凋亡从而减少其增殖[9-13]，其已成为抗肿瘤的最佳治疗方式。已有研究表明，氯化两面针碱在体外可通过阻断AKT通路诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡[14]。恶性肿瘤不同于其他疾病的另外一个特征就是能通过淋巴系统或内循环系统侵袭和迁移至其他组织[15]，并在其他组织中继续不断生长，即为肿瘤转移，这种转移性是导致肿瘤复发和治疗失败非常重要的原因[16-17]。

喉癌与细胞凋亡、分化、侵袭和转移等细胞生物学行为密切相关，侵袭和迁移是喉癌易侵犯周围组织的主要原因[18-20]，已有的手术、靶向治疗和放疗等多种方案对于部分喉癌早期的治疗可获得较好的效果，但是晚期患者的临床疗效欠佳，并常因喉癌的复发或转移影响治疗或导致死亡[21-22]。如能有效抑制喉癌生长，并抑制其向周围转移，可极大地提升喉癌的治愈率。

中医药博大精深，用中药制剂辅助治疗癌症已成为趋势[23-25]，氯化两面针碱是一个非常有前景、可防治肿瘤的中药，其抗肿瘤的作用较广泛，体外研究证实其能有效抑制胃癌、鼻咽癌等多种肿瘤的生长[26-27]。本研究将氯化两面针碱作用于人喉癌Hep-2细胞，分别采用MTT法、Transwell法、Annexin V-FITC/PI双染法探讨氯化两面针碱对Hep-2细胞增殖、侵袭和迁移的抑制及诱导凋亡的潜在作用机制。研究結果显示，氯化两面针碱能显著抑制人喉癌Hep-2细胞的生长，并且在5～80 μmol/L的浓度和24～72 h的时间范围内，随着浓度和时间的增加抑制率也逐渐增加。Annexin V-FITC/PI检测发现，氯化两面针碱诱导Hep-2细胞的凋亡率随着浓度的增加而升高。Transwell实验表明，氯化两面针碱浓度越高，Hep-2细胞侵袭和迁移的细胞数也越少，提示其可浓度依赖性地降低Hep-2细胞的侵袭和迁移能力。这与氯化两面针碱可以剂量依赖性地抑制SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力结果是一致的[28]。

综上，氯化两面针碱可通过诱导Hep-2细胞凋亡来抑制其生长，并能减少Hep-2细胞的侵袭和迁移的数量而抑制其转移，这为临床治疗喉癌提供了一定的研究基础，但是氯化两面针碱抑制Hep-2细胞侵袭和迁移的能力是否与时间有关，以及通过何种机制抑制其迁移，尚需进一步实验证实。

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