miR93和miR21联合检测对2型糖尿病视网膜病变进展的预测价值

马 宇，周利晓，刘 意，武 卫

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管病变的重要表现，是糖尿病患者致死致残的主要原因，临床常表现为视物模糊、视力下降、失明等，是中老年常见的致盲眼病，严重影响全球成千上万人的生活质量[1]。流行病学显示，在我国糖尿病病史20a的患者患病率几乎为100%，其发病机制尚未明确，且临床无有效治愈方法，因此寻找DR发生早期诊断标志物并及时治疗是延缓其进展的关键所在[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是在真核生物中发现的一类具有调控功能的小分子非编码单链RNA，其作为调控细胞功能的关键因子，参与炎症的发生与发展过程，大量研究表明诸多疾病患者血液中存在miRNAs的特异性表达，并与眼底肿瘤的发生和发展关系密切。miR93和miR21作为具有炎性作用的多功能分子，其异常表达参与了糖尿病、冠心病、血管内皮细胞损伤等诸多慢性低度炎症性疾病[3-4]。有学者研究发现，miR93和miR21在眼部疾病中异常表达，对眼部疾病的早期诊断具有高度特异度和敏感度[5]。但国内关于miR93和miR21联合检测在DR患者发病机制的参与和调控作用的报道较少，因此本研究通过检测DR患者血清中miR93和miR21的表达变化，探讨两指标联合检测在DR病变进展中的预测价值，为临床新的治疗提供理论依据。

表1 三组一般资料和生化指标比较

指标DR进展组DR非进展组对照组χ2/F/tP性别(男/女,例)27/1518/1623/221.7360.419年龄(x±s,岁)59.21±8.2360.85±7.4753.12±9.231.0200.364病程(x±s,a)14.37±8.7510.25±4.74-0.5470.585BMI(x±s,kg/m2)22.75±2.5122.36±2.4122.93±2.840.4700.626FPG(x±s,mmol/L)9.25±1.56b,d7.17±0.83b4.76±0.69180.71<0.001HbA1c(x±s,%)7.85±0.69b,d5.89±0.58b4.16±0.41459.15<0.001TC(x±s,mmol/L)4.27±0.854.16±1.044.08±0.840.4800.619TG(x±s,mmol/L)1.51±0.391.48±0.421.47±0.510.0600.940LDL-C(x±s,mmol/L)3.23±0.513.18±0.523.13±0.460.4400.643

注：对照组：健康体检者。bP<0.01vs对照组；dP<0.01vsDR非进展组。

1对象和方法

1.1对象选取本院2013-06/2014-06收治的2型DR患者(T2DM)76例，其中男45例，女31例，年龄59.41±7.52岁，T2DM病程15.7±9.2a。入组标准：(1)符合WHO 1999年T2DM诊断标准，符合DR国际临床分级标准[6]；(2)年龄≤80岁；(3)体质量指数(BMI)≤24kg/m2者；(4)入院前无眼部外伤和手术史；(5)患者和家属知情同意并配合治疗者。排除标准：(1)合并严重肝肾功能不全者；(2)合并急慢性感染、风湿结缔组织疾病者；(3)合并其他恶性肿瘤者；(4)合并大血管和微血管病变者；(5)接受新生血管药物治疗及有眼部手术史者；(6)患者研究中途退出，导致临床数据缺失者。根据4a随访结果，依据DR有无进展，将患者分成DR非进展组(34例)和DR进展组(42例)，另选取45例在我院健康体检者为对照组。本研究经医院伦理会知情批准及受试者同意。

1.2方法

1.2.1 DR检测方法采用免散瞳眼底摄片法(免散瞳眼底照相机)进行视野眼底照片。由2名经验丰富未知患者信息的眼科医生分别进行读片。根据DR的国际临床分级标准，将DR按照严重程度分为2组：(1)非增殖性DR(NPDR)，包括轻度、中度、重度的NPDR；(2)增殖性DR(PDR)。DR进展的定义为由较轻病情向较重病情发展；非进展表示基线和4a随访时患者的DR严重程度无明显进展。

1.2.2生物指标检测收集所有研究对象性别、年龄、BMI等一般资料。生化指标检测：收集所有患者入院后第2d晨起空腹静脉血5mL，对照组研究对象为体检时静脉血，经离心后分离血清，采用免疫比浊法检测糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)水平，采用全自动生化检验分析仪检测所有研究对象总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerin，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等血脂水平，采用血糖仪检测空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)水平。

组别例数miR93miR21DR进展组421.95±0.38b,d1.98±0.40b,dDR非进展组341.10±0.151.20±0.21对照组451.05±0.111.12±0.19 F18.70711.920P<0.001<0.001

注：对照组：健康体检者。bP<0.01vs对照组；dP<0.01vsDR非进展组。

1.2.3 miRNA逆转录实时荧光定量PCR检测采用总RNA提取试剂Trizol从100μL血清中提取总RNA，在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应，检测血清中miR93和miR21水平的变化。以U6 snRNA为内参基因，采用2-△△ct计算miRNA相对表达量水平，其中△Ct = Ct目的基因-CtU6。

2结果

2.1三组一般资料和生化指标比较三组研究对象在年龄、性别、BMI方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。三组TC、TG、LDL-C等生化指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，DR非进展组和DR进展组患者HbA1c及FPG水平较对照组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，且DR进展组明显高于DR非进展组(P<0.01，表1)。

2.2各组血清中miR93和miR21表达量的变化DR进展组患者血清中miR93和miR21水平较DR非进展组、对照组明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；DR非进展组miR93和miR21水平略高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

2.3影响DR患者病变的独立危险因素COX回归分析结果显示，患者血清miR93和miR21水平是DR进展的独立危险因素(表3)。

表3 COX回归分析影响DR患者病变的独立危险因素

指标危险比(HR)回归系数(B)标准误(SE)WaldP95%置信区间上部下部性别1.210-0.0390.0890.1780.6481.3240.692年龄1.037-0.0500.0391.1400.2591.1780.925BMI1.2400.0810.0511.8790.2161.7530.717FPG1.5981.5970.0602.8170.1023.1750.784HbA1c1.6100.0700.0512.1870.1622.6540.659TC1.7310.0970.0493.2400.0712.7720.750TG0.9140.1040.3166.6260.6971.4370.581LDL-C1.6420.0730.0572.4610.0971.7130.766miR932.7041.31705799.147<0.0014.6252.026miR212.0520.7280.3588.416<0.0013.7141.517

表4 miR93和miR21单独与联合检测对DR进展的预测价值

指标特异度(%)敏感性(%)曲线下面积miR9381890.883(0.813～0.950)miR2171900.845(0.769～0.914)miR93+miR2187920.946(0.857～0.993)

图1miR93和miR21单独与联合检测预测DR进展的ROC曲线。

2.4 miR93和miR21单独与联合检测评估DR预后的价值ROC曲线分析结果显示，miR93和miR21联合检测曲线下面积、特异度与敏感度均高于单独检测，差异有统计学意义(P<0.05，表4，图1)。

3讨论

DR是糖代谢异常造成的眼部疾病，在我国随着糖尿病发病率的提高，DR的发生率与致盲率也呈上升趋势，其发病率是一般人群的25倍，DR可造成黄斑水肿、玻璃体出血，导致患者视力下降、视物变形，严重威胁着患者生存质量[7-8]。目前DR发病机制尚未完全明确，诸多学者认为与自然免疫和炎症损伤密切相关。

近年来炎症反应与血管病变间的关系已成为临床学者关注的重点，miR93和miR21作为炎症反应的调节因子，在DR病情进展中，可能与患者血管内皮功能障碍和血管综合征的发生有关[9]。在PDR中，与血管生成和纤维化相关的几个小RNA的表达显著较高[10]。miR93和miR21参与糖尿病微血管病变的发生机制，国外有学者通过动物实验模型发现[11-12]，在DR大鼠模型中内皮细胞的miR93和miR21表达显著高于对照组，其可进一步激活炎症介质通路，促进血管炎症的发生，其可通过诱导细胞分化和调节炎症反应参与DR的进展[13]，有研究显示，miR93和miR21参与糖尿病微血管病变的发生发展，且不同病变程度患者其表达量不尽相同[14]。血浆中miR-93在DR患者中异常高表达，并与DR患者的增生膜活力及进展相关[15]，miR93发挥作用的机制可能为其靶基因血管内皮生长因子A，在血管生成及维持毛细血管完整性方面具有重要意义[16]。又有资料显示，miR93可通过抑制整合素β-8的表达，进一步证实其在病变组织血管生成和肿瘤生长等方面的作用[17]。有研究表明miR-21的表达与病程、HbA1c、FPG和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)呈正相关。多元线性回归分析证实，病程、HbA1c、FPG和HOMA-IR均是影响血浆miR-21表达的主要因素[18]，提示miR-21可能参与到糖代谢过程之中。

本研究结果显示，DR进展组患者血清中miR93和miR21水平明显高于DR非进展组与对照组，说明血清中miR93和miR21在DR患者中异常高表达，并与DR进展具有明显相关性。本研究通过COX回归分析结果显示，患者血清miR93和miR21水平是影响DR患者病情进展的独立危险因素。为明确miR93和miR21对DR进展的预测价值，本研究绘制了ROC曲线，结果显示miR93和miR21联合检测曲线下面积(0.946)、特异度(95%)及敏感度(96%)均高于单独检测，这提示miR93和miR21联合检测可明显提高对DR进展的预测价值。

综上所述，miR93和miR21在DR进展期患者血清中水平异常增高，是影响DR患者病情进展的独立危险指标，两者联合检测可明显提高对DR患者病情的预测价值。