OCTA分析埃罗替尼对小鼠角膜厚度的影响

袁 晴，刘康成，黎 彪，朱佩文，林 启，闵幼兰，石文卿，叶 蕾，邵 毅

0引言

在细胞膜上的受体中，表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)是一种酪氨酸激酶受体，对上皮细胞的发育起着重要的作用，并在正常生理过程中扮演重要的角色。如促进细胞增殖、分化和迁移等[1]。我们前期研究发现，EGFR介导的信号传导可以激活AKT细胞内的磷酸化，从而导致眼部一些细胞的增殖、分化和迁移[2-4]。而埃罗替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，其主要针对EGFR发挥作用，该抑制剂可用于非小细胞肺癌[5]、胰腺癌[6]等晚期癌症的使用。但是，当EGFR在抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥作用时[7]，可能出现恶心、腹痛等消化道症状[8]。有研究表明，埃罗替尼已知的眼部副作用是眼部表面疾病、角膜结膜炎、干眼等[9-10]，但是其对角膜的具体影响程度很难评估。

光学相干断层扫描血管造影(optical coherence tomography angiography, OCTA)作为新型的非侵入性成像技术，能够在极短时间内同时对病变深度以及异常血流情况进行评估，对于眼部病变范围及深度有着更为直观、精确的成像[11]，本课题组希望通过应用OCTA对小鼠角膜上皮和角膜全层厚度的测量，探究埃罗替尼对眼表的影响，并为干眼的相关机制提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料埃罗替尼滴眼液制备：(1)应用无菌PBS溶液将埃罗替尼(Tarceva©，Roche，USA)稀释至20μmol/L；(2) 超声涡旋(37℃)均质化；(3)加入防腐剂：0.005%苯扎溴铵；(4)4℃冰箱保存。实验动物于南昌大学医学院动物实验中心购买6～8周龄的Balb/c小鼠(均为SPF级实验动物)，从中选取体质量18～21g的小鼠20只。所有小鼠经眼前节、眼底进行眼部相关检查无异常。Schirmer I试验结果≥10mm/5min[12]。小鼠于25℃±1℃的标准环境中，明暗交替饲养各12h。为控制变量，所有相关操作均由一人操作完成。本次研究在充分考虑实验动物利益的前提下，尽可能减少对实验动物造成的伤害，尊重动物的生命，实验涉及的全部研究方法均遵循《赫尔辛基宣言》及动物伦理委员会的要求，同时获得了南昌大学医学院动物伦理委员会批准。

1.2方法将所选20只小鼠随机均分为埃罗替尼组10只，PBS组10只。埃罗替尼组应用前述制备的埃罗替尼滴眼液5μL点双眼，PBS组应用PBS 5μL点双眼，其点眼时间均为每日8∶00、12∶00、16∶00和20∶00。在点眼前和点眼后1、2、3wk后，应用OCTA观察角膜情况，测量角膜上皮和角膜全层厚度。为控制变量，所有相关操作均由一人操作完成。

1.2.1角膜区域的划分参照文献[13]，应用AngioVue OCTA系统(Optovue，Inc.，Fremont，CA)自动将角膜划分出17个区域：按照直径2、5、6mm划为角膜中央(M)、内环和外环。且内环和外环各分为八等分：上侧(S)、鼻上侧(SN)、鼻侧(N)、鼻下侧(IN)、下侧(I)、颞下侧(IT)、颞侧(T)、颞上侧(ST)。

1.2.2 OCTA操作及数据分析参照文献[13]上述角膜划分的17个区域应用OCTA测量其上皮和全层的局部厚度和变化量，扫描埃罗替尼组和PBS组小鼠的角膜中央直径2mm区域和内环、外环各分区的图像，对双眼数据进行叠加，将各区域角膜上皮和角膜全层厚度的平均值制成图形。

2结果

2.1埃罗替尼对小鼠角膜上皮厚度的影响两组不同时间的角膜上皮各区域厚度差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1、2。埃罗替尼组与PBS组相比，点眼前17个区域角膜上皮厚度比较差异无统计学意义(均P>0.05)；点眼后1wk，与PBS组相比，埃罗替尼组角膜上皮下部厚度的M、IT5、I5、IN5、IT6、I6、IN6区域明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)；点眼后2wk，与PBS组相比，埃罗替尼组小鼠角膜上皮厚度的M、T5、IT5、I5、IN5、N5、T6、IT6、I6、IN6、N6区域均明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)。与PBS组相比，点眼后3wk埃罗替尼组小鼠17个区域的角膜上皮厚度均明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)。随着点眼次数的增加，点眼后3wk，埃罗替尼组各区域厚度较点眼前明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2埃罗替尼对小鼠角膜全层厚度的影响两组不同时间各区域角膜全层厚度比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表3。与PBS组相比，点眼前埃罗替尼组17个区域的角膜厚度无明显改变，比较差异无统计学意义(均P>0.05)；点眼后1wk，与PBS组比，埃罗替尼组小鼠角膜全层下部厚度的IT5、I5、IN5、IT6、I6、IN6区域明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)；点眼后2wk，与PBS组相比，埃罗替尼组小鼠角膜全层厚度的M、T5、IT5、I5、IN5、N5、T6、IT6、I6、IN6、N6区域均明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)；点眼后3wk，与PBS组相比，埃罗替尼组小鼠角膜17个区域全层厚度均明显增厚，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

2.3不同时间点两组小鼠角膜上皮厚度和角膜全层厚度平均值比较两组不同时间角膜上皮厚度平均值比较，差异有统计学意义(F组间=17.64，F时间=21.24，F组间×时间=12.17，均P<0.05)；两组不同时间角膜全层厚度平均值比较，差异有统计学意义(F组间=6.14，F时间=10.65，F组间×时间=6.29，均P<0.05)，见表4、5。

3讨论

EGFR是一种广泛分布于角膜中的重要酪氨酸激酶受体[13]，它在眼睛发育和光受体分化中起着至关重要的作用[14-16]。EGF作为细胞因子，在角膜上皮细胞的自我更新和保持角膜微环境的稳定性方面中发挥重要作用[17]。EGF与EGFR结合后，可以激活一系列信号转导途径，诱导蛋白磷酸化并导致细胞的快速分化和增殖，加速角膜损伤的愈合[18]。而埃罗替尼具有可逆性和选择性，可以对EGFR的磷酸化和相关的酪氨酸激酶活性产生抑制作用，从而达到抑制细胞分裂、阻断血管发生、引起细胞凋亡的作用[19]。以前的研究报道，结膜和角膜上皮细胞凋亡与干眼病密切相关[20-21]。

根据我们的研究结果可以发现，经过埃罗替尼滴眼液处理的小鼠，其角膜上皮厚度和角膜全层厚度均有不同程度的增厚，且随着点眼次数的增加，其增厚的程度越为明显。因此，我们认为，经埃罗替尼治疗的肿瘤患者，其体内的埃罗替尼可以进入泪液，并对角膜产生刺激，阻断EGFR信号通路的传导，破坏角膜微环境的稳定性，代偿性引起角膜细胞的增殖和修复，从而产生和本次实验结果相类似的情况。Morishige等[22]也曾报道因埃罗替尼治疗引起角膜穿孔的病例，这在一定程度上证实埃罗替尼对角膜微环境的稳定性存在明显的影响。同时有研究认为，EGFR对角膜上皮细胞具有抑制作用，而埃罗替尼对其有着不利影响[23-24]，而我们的实验结果一定程度上可以证实，埃罗替尼的使用使得角膜代偿性地出现增厚。

分区点眼前埃罗替尼组PBS组tP点眼后1wk埃罗替尼组PBS组tP点眼后2wk埃罗替尼组PBS组tP点眼后3wk埃罗替尼组PBS组tPM66±665±61.0250.09371±9∗66±73.4210.04274±12∗66±65.4310.02276±13∗67±76.3210.020S566±765±61.0690.09270±1066±71.9740.05472±1165±82.0320.05276±12∗66±84.5490.047ST565±664±51.0110.09467±966±71.0920.09271±1166±71.6450.05573±12∗65±64.8950.034T570±869±91.0320.09572±1070±101.8390.08574±13∗70±94.3260.03975±14∗71±103.5420.042IT566±867±71.0450.09374±11∗68±104.3090.03973±10∗69±94.8460.03677±11∗68±95.3250.033I567±867±90.9420.09975±10∗67±95.4320.02378±9∗68±105.5640.02079±10∗68±95.9740.020IN568±868±80.9110.10073±13∗68±113.2460.03474±14∗68±73.5830.03276±15∗68±83.6370.030N567±768±71.0210.09270±1068±81.4350.06573±11∗68±93.5470.03177±12∗68±103.9720.029SN566±766±70.9210.10068±867±91.3120.05972±1268±81.1640.05776±13∗67±82.6790.046S667±867±71.0110.09669±1067±81.4320.07771±1167±91.4320.07071±12∗68±102.5640.043ST664±764±60.9970.09865±965±71.0320.09770±1166±101.1350.05672±13∗66±103.5420.039T667±868±81.2310.09570±1170±81.0210.09674±10∗70±102.2490.04476±11∗71±113.5190.034IT666±766±61.0210.09872±10∗68±74.9320.04476±11∗68±95.5620.03278±10∗68±105.6530.021I668±967±91.3250.09573±11∗66±105.7470.02374±11∗67±105.4320.02175±11∗69±104.5020.034IN661±859±81.2310.09766±11∗58±95.4210.03567±12∗57±106.5190.02968±13∗57±105.6530.033N667±866±81.0230.09570±1067±91.5420.08974±11∗66±85.4560.02277±12∗68±75.4210.025SN669±769±60.9910.09970±970±61.0210.09473±1070±91.3240.05974±11∗70±83.4310.044

注：从第1wk起，逐渐增加埃罗替尼的使用次数，可以发现角膜上皮下方各区最先增厚，其他区域随后增厚。*：埃罗替尼组点眼前后角膜上皮厚度明显增厚的区域。

表2 两组角膜上皮厚度重复测量数据的方差分析结果

分区角膜上皮厚度F组间P组间F时间P时间角膜上皮厚度变化趋势F组间×时间P组间×时间M19.3210.03427.4310.0319.4350.021S521.4320.03129.8420.0239.4380.026SN518.4770.02822.4320.0229.0320.022N516.7210.02730.3540.0329.4730.028IN517.8450.02929.0430.0219.5720.031I521.4920.03531.0530.0199.7540.025IT520.4810.03930.4310.0279.5730.022T519.0470.03129.0450.0239.5820.029ST522.4810.02822.5630.0299.6310.027S615.4310.03823.5740.0338.9540.033SN619.3280.04226.5490.02710.3520.028N618.3910.04622.5140.02511.4630.019IN619.5730.03526.7420.0219.8430.022I618.9420.03723.6920.02410.7720.018IT621.0340.04122.6470.0229.4720.021T620.8410.04428.5480.0199.5610.019ST617.8380.04122.4210.0229.3240.022

干眼症是由多种因素引起的眼部症状，包括泪膜不稳定性，视力变化和潜在的眼表面损伤，减少的泪液渗透压和增加的眼部炎症[25]。研究发现，埃罗替尼在治疗肿瘤的同时，导致了许多患者的泪管功能障碍[26]或角膜上皮性疾病[27]的发展，最终导致角膜糜烂，甚至出现溶解和穿孔的情况[10,28]。这可能是由于埃罗替尼经泪液中到达角膜，刺激了来自于驻留的角质细胞的蛋白酶的释放，从而导致了基质胶原蛋白的降解，从而导致上皮缺陷。我们前期的研究发现[29]，埃罗替尼引起了类似于干眼病的眼表面损伤。从组织病理学结果可以发现经埃罗替尼处理的小鼠角膜上皮细胞无序排列，细胞数量增多，细胞结构不清晰。因此，我们可以认为，埃罗替尼的使用在一定程度可能导致角膜上皮损伤，炎症等情况的发生，而这些因素都可能最终导致干眼症的出现。

泪膜的不稳定是导致干眼的重要因素，而细胞凋亡，减少的杯状细胞和粘蛋白表达的变化均有可能导致泪膜不稳定性增加，激活炎症反应，从而引起眼表上皮细胞不断损伤[30]。此外，根据以前的研究结果，EGF对促进杯状细胞的增殖具有促进作用，从而增加泪膜的稳定性[31-32]。而埃罗替尼可能使得杯状细胞的数量减少，导致杯状细胞中粘蛋白分泌减少，造成干眼症。

分区点眼前埃罗替尼组PBS组tP点眼后1wk埃罗替尼组PBS组tP点眼后2wk埃罗替尼组PBS组tP点眼后3wk埃罗替尼组PBS组tPF组间P组间F时间P时间M142±11141±121.1320.098147±11140±122.3110.068149±11∗141±103.4530.049154±13∗142±114.3410.0448.6530.01911.4360.034S5247±10248±111.0140.097256±12249±112.4390.076259±16248±112.1170.052262±18∗249±114.3210.0429.7640.02113.5830.031ST5205±14203±131.3250.095210±16203±132.5630.067215±16205±132.0150.055218±19∗203±134.9310.0449.5720.02211.4350.025T5180±14179±141.0110.098188±18179±142.1350.065193±17∗180±143.4120.046198±18∗179±144.3250.04210.5530.02817.4360.026IT5212±11211±101.0190.096221±15∗212±103.5490.046223±17∗213±104.2310.041226±19∗211±104.3010.0410.6430.02712.6170.028I5222±14224±170.9950.098231±17∗223±173.6570.045233±14∗221±174.2190.04237±17∗224±175.6210.02311.4320.02211.4360.022IN5209±14208±130.9140.099217±16∗210±133.7520.041222±18∗209±133.9320.042226±20∗207±134.5210.0399.0430.01812.9530.027N5213±12212±111.1230.097218±15212±122.1270.057222±17∗214±113.8140.045224±19∗213±114.3210.03410.3210.02813.7530.022SN5169±13168±120.9540.097174±15168±132.3150.056179±18169±121.3210.084184±20∗168±134.7310.0438.9460.02316.4390.028S6268±20266±191.0240.097272±20268±192.4190.072275±21267±192.6420.07280±22∗269±194.9310.0419.3340.02112.5430.028ST6254±18254±161.0190.098256±19254±162.4330.072259±18254±162.7120.07261±19∗252±164.4320.0399.0430.01713.5470.019T6217±15217±131.1930.096221±16217±142.4950.065225±18∗218±153.7480.041228±19∗217±155.4390.0419.4510.02212.7640.024IT6232±14234±131.0190.097238±17∗234±144.1190.049242±18∗233±135.0190.032244±19∗236±135.9430.03110.3420.01811.5570.022I6200±14199±161.0320.098212±12∗198±165.5110.033214±17∗200±165.9320.022216±19∗198±166.2340.029.4530.01612.5490.025IN6191±12189±130.9820.098198±16∗189±154.5170.042203±19∗191±135.4210.032209±21∗190±135.1110.0310.6750.02214.6180.033N6193±15192±140.9140.099197±16193±141.3520.061202±17∗194±144.3390.043206±19∗193±134.8320.0329.7530.01913.6570.038SN6186±12188±111.1130.096190±15188±102.2170.077192±17189±112.5420.054196±18∗188±113.2140.04610.2840.01811.5460.034

注：点眼后第1wk开始，埃罗替尼使用次数逐渐增加，角膜全层厚度逐渐变厚，且下方各区域先增厚，随后其他区域增厚。*：埃罗替尼组点眼后与点眼前对比角膜全层厚度显著增厚的区域。

分组点眼前点眼后1wk点眼后2wk点眼后3wkPBS组66.18±7.1766.88±7.9467.34±8.7167.41±8.88埃罗替尼组66.47±7.4770.29±10.06a72.94±11.17 a75.06±12.06 a t0.9433.2144.9655.639P0.0970.0430.0240.020

注：aP<0.05vs点眼前。

分组点眼前点眼后1wk点眼后2wk点眼后3wkPBS组207.82±13.41208.06±13.71208.59±13.41208.18±13.47埃罗替尼组208.24±13.71214.47±15.65218.06±17.36 a221.71±18.76 a t0.9372.3613.5494.045P0.0960.0550.0460.041

注：aP<0.05vs点眼前。

总之，埃罗替尼确实导致角膜一定程度的增厚，也在一定程度上可能导致了干眼症状的出现，但其造成干眼症的机制尚未明确，需要更多的实验进一步探究其发生的原因。