大黄素对烟曲霉菌性角膜炎模型大鼠的抗炎作用机制研究

勾晓梅，李雪丽，隋 源，周丽霞

0引言

烟曲霉菌是一种致病性较强的病原菌，数据显示，因烟曲霉菌感染导致角膜炎症发生的研究增多[1]。近年来我国患烟曲霉菌性角膜炎的人数也在逐年增加，严重制约人们的生活水平，影响人们的身心健康[2]。大黄素主要从大黄中提取出来，是大黄的主要有效成分[3]。大黄素药理性质广泛，具有抑菌消炎、保肝利尿的功效，同时还可以调节免疫系统[4]。本实验通过大黄素对烟曲霉菌性角膜炎模型大鼠进行治疗，研究其抗炎作用机制。

1材料和方法

1.1材料选取30只雄性健康清洁级SD大鼠，体质量215～255(平均225.5±10.2)g，鼠龄9～12(平均10.5±0.3)mo，均符合动物保护条例。由广西医科大学实验动物中心提供，大鼠饲养严格按照动物饲养标准规程操作，环境温度保持于22℃～25℃，湿度45%～55%，每小时通风6～10次，每天按时给水及添加饲料，每2d更换垫料1次。烟曲霉菌菌种由中国科学院微生物研究所菌种保存中心提供。本研究经过我院伦理委员会批准。主要试剂和仪器：大黄素(广东中山康之源生物有限公司提供)；流式细胞仪、Western blot试剂盒(天津九鼎公司)；PPAR、MAPK、NF-κB一抗和二抗(英国Abcam公司提供)。

组别数量(只)角膜炎症指数(分)角膜炎症细胞计数(个/视野)正常组103.15±0.5540.25±10.16模型组86.25±1.55a90.12±17.25a大黄素组84.31±0.35a,c59.45±13.36a,c F8.87111.494P<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs模型组。

1.2方法

1.2.1烟曲霉菌性角膜炎模型建立将菌种在Sabouroud培养基中接种，在25℃环境下培养1wk，采用灭菌水配置真菌孢子悬浊液，将孢子浓度调整为1×108CFU/mL。选取20只大鼠制备烟曲霉菌性角膜炎模型。参考任毅等[5]模型建立并适当进行改正，在制备前使用5g/L左氧氟沙星滴眼液滴注双眼，4次/d，连续滴注3d。之后采用3.5mL/kg 10%水合氯醛进行腹腔麻醉，采用1%盐酸丁卡因滴注大鼠双眼，常规消毒后，采用4mm环钻在角膜中间进行定位，将角膜上皮清除后，覆盖直径6mm的软性角膜接触镜，将浓度为1×108CFU/mL的悬浊液注入镜片与角膜层之间，在结膜囊位置涂抹氧氟沙星眼膏，之后采用5-0丝线将上下眼睑缝合。手术9h后拆线，将软性角膜接触镜移除。建模48h后，发现大鼠角膜白润病症深度加深，范围扩大，覆盖整个眼球，说明建模成功。

1.2.3角膜炎症指数统计角膜炎症指数评分以病灶大小、病变深度为标准。病灶大小：病灶占角膜总面积的1%～25%，记为1分；病灶占角膜总面积的>25%～50%，记为2分；病灶占角膜总面积>50%～75%，记为3分；病灶占角膜总面积的>75%～100%，记为4分。病变深度：角膜显示轻度混浊，但瞳孔和虹膜清晰，记为1分；角膜浅层显示灰白色混浊，瞳孔和虹膜通过病灶可以观察到，记为2分；角膜全层不透明，显示不均匀的混浊，记为3分；角膜显示均匀致密混浊，记为4分。

1.2.4病理学观察提取大鼠角膜组织，在10%甲醛缓冲液中保持48h，之后脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡处理后，采用HE进行染色，在显微镜下观察大鼠角膜病理学特征，并对角膜炎症细胞进行计数。

1.2.5酶联免疫吸附测定法TNF-α、IL-6、ICAM-1指标检测采用50mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解，浓度为10～20μg/mL，在96孔酶标板中加入100μL/孔，4℃过夜保存。第2d舍弃包被液，采用PBST洗涤3次，每孔中加入150μL 1% BSA，在37℃环境中封闭1h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100μL不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37℃孵育2h。采用PBST洗涤5次，加入100μL稀释后的HRP标记二抗，37℃孵育1h。PBST洗涤5次，之后使用显色剂显色20min后，在酶标仪上读取A405吸收值。

1.2.6 Western blot检测PPAR、MAPK、NF-κB蛋白表达将采集到的标本使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，进行裂解35min，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。取20μg/孔蛋白质，通过10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15min；100V电泳10min，结束之后，将电转膜浸泡在10%牛奶中，在37℃环境下的摇床上封闭1.5h；与一抗(稀释浓度1∶10000)结合，加入TBST稀释按1∶1000稀释一抗Tubulin(内参照)，在4℃环境下孵育过夜保存；第2d用TBST缓冲液清洗，与二抗(稀释浓度1∶10000)结合在室温下孵育1h，再次用TBST缓冲液反复清洗。最后加入显影剂将其仅在底物溶液中进行显色，分析其灰度值，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量，分析PPAR、MAPK、NF-κB蛋白表达量。

2结果

2.1三组大鼠角膜炎症指数和角膜炎症细胞计数比较如表1所示，三组大鼠角膜炎症指数和角膜炎症细胞计数比较，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠角膜炎症指数和角膜炎症细胞计数高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素组大鼠角膜炎症指数和角膜炎症细胞计数低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素组大鼠角膜炎症指数和角膜炎症细胞计数高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2三组大鼠角膜组织病理学观察正常组大鼠角膜组织上皮表现完整，未见炎性细胞浸润。模型组大鼠角膜组织胶原纤维发生肿胀，排列紊乱，有大量炎性细胞浸润，坏死组织脱落，形成溃疡。大黄素组大鼠角膜组织炎性细胞减少，胶原纤维排列整齐(图1)。

2.3三组大鼠TNF-α、IL-6、ICAM-1水平比较三组大鼠TNF-α、IL-6、ICAM-1水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠TNF-α、IL-6、ICAM-1水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素组TNF-α、IL-6、ICAM-1水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素组TNF-α、IL-6、ICAM-1水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.4三组大鼠PPAR、MAPK、NF-κB的蛋白表达比较三组大鼠PPAR、MAPK、NF-κB的蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠PPAR蛋白表达低于正常组，MAPK、NF-κB蛋白高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素组PPAR蛋白表达高于模型组，MAPK、NF-κB低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素组PPAR蛋白表达低于正常组，MAPK、NF-κB表达高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05，表3，图2)。

图1三组大鼠角膜组织病理学观察(HE)A：正常组(×200)；B：模型组(×400)；C：大黄素组(×200)。

组别数量(只)TNF-αIL-6ICAM-1正常组10353.15±20.55140.25±11.1638.66±5.45模型组8468.25±50.55a290.12±20.25a68.42±10.33a大黄素组8382.11±10.85a,c189.45±15.36a,c45.36±8.62a,c F9.88630.00711.820P<0.01<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs模型组。

组别数量(只)PPARMAPKNF-κB正常组101.15±0.060.32±0.050.42±0.03模型组80.25±0.05a1.25±0.08a1.36±0.05a大黄素组80.88±0.04a,c0.95±0.03a,c1.06±0.02a,c F50.96342.92679.157P<0.01<0.01<0.01

注：aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs模型组。

3讨论

真菌性角膜炎致病菌是真菌，是一种感染性角膜病。真菌性角膜炎与长时间配戴角膜接触镜和使用抗生素有关[7]。我国主要的致病真菌主要有镰刀菌属、曲霉菌属和念珠菌等[8]。烟曲霉菌属于曲霉菌属，烟曲霉菌角膜炎使用一般的抗菌药物治疗，很难完全杀死，增大了治疗难度，严重时会导致角膜溃疡、角膜穿孔甚至失明[9]。本研究中，建立烟曲霉菌性角膜炎大鼠模型，选择将悬浊液注入角膜接触镜镜片与角膜层之间，其操作简单，时间短，建模成功率较高。

研究表明，多种细胞因子参与了真菌性角膜炎的发生和发展，细胞因子表达水平与炎症的发生和发展以及角膜损伤的严重具有相关性[10]。有研究指出，大黄素能够提高角膜闭锁蛋白表达量，保护角膜屏障完整，降低中性粒细胞的浸润程度，减少角膜损伤[11]。本研究结果显示，大黄素组大鼠角膜炎症指数和角膜炎症细胞计数降低，说明大黄素可以降低大鼠角膜炎症指数，减少角膜炎症细胞数量。高红刚等[12]指出，大黄素能够抑制眼部碱烧伤炎症。本研究也说明大黄素的抑制炎症作用明显。IL-6是炎症发热反应的重要因子，某些肿瘤细胞会自身诱导形成IL-6，促进肿瘤细胞的增殖生长，IL-6在人体内参与多种炎症反应和疾病，属于促炎因子[13-14]。TNF-α能够刺激免疫活性细胞产生白细胞介素等炎症因子，但是TNF-α在机体中过多表达，会促使T细胞产生各种炎症因子，从而造成机体细胞的损坏[15]。ICAM-1是一种重要的黏附分子，主要介导细胞间的黏附反应，参与细胞间的信号转导和活化过程，促进细胞生长和分化，在炎症反应过程中发挥着重要作用[16]。本研究结果显示，大黄素组TNF-α、IL-6、ICAM-1水平降低，说明大黄素可以改善大鼠的TNF-α、IL-6、ICAM-1水平，起到抑制炎症的作用。Chen等[17]指出，大黄素能够缓解角膜水肿和炎性细胞浸润程度，降低角膜组织中TNF-α、ICAM-1水平，与本研究结果保持一致。

图2三组大鼠PPAR、MAPK、NF-κB蛋白表达Western blot图。

本研究显示，大黄素组PPAR蛋白表达升高，MAPK、NF-κB表达降低，说明大黄素对MAPK、NF-κB有抑制作用，促进PPAR蛋白表达，大黄素通过抑制NF-κB活化，能够减少炎性细胞因子的释放，从而对组织起到一定的保护作用。陈国玲等[6]研究也指出，大黄素能改善其NF-κB蛋白表达，本研究与其保持一致。NF-κB可以与多种基因启动因子进行特异性结合，促进基因转录，NF-κB通过对下游基因进行转录，起到对炎症因子网络调节作用[18-19]。PPAR、MAPK是NF-κB重要的调节蛋白[20]。通过本研究说明，大黄素其可能的作用机制是激活NF-κB相关通路，控制PPAR、MAPK表达，通过抑制NF-κB调控TNF-α、IL-6、ICAM-1水平，抑制炎性释放，降低炎性反应。

2李冰，陈一强，孔晋亮，等.黄芩素联合两性霉素B对烟曲霉菌生物被膜的体外作用.山东医药 2016；56(4):5-7

5任毅，甘胜伟，李平华，等.Dectin-1和 TLR4在烟曲霉菌性角膜炎大鼠角膜组织中的表达及其在角膜炎发病中的作用.吉林大学学报(医学版) 2015；41(6):1176-1180