3 个品牌干腌火腿皮下脂肪挥发性风味比较分析

谭椰子，周光宏，徐幸莲，刘 源，李春保,*，张丹妮*

（1.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；3.北京工商大学食品质量与安全北京实验室，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048）

风味是人们评定食品的重要指标之一[1]。干腌火腿风味在中华传统特色肉制品中独树一帜，中国著名的3 大干腌火腿分别是金华火腿、宣威火腿与如皋火腿，也是中国产量及销量多且广受好评的腌腊肉制品[2-4]。干腌火腿的风味形成途径[5]包括脂类的氧化降解[6]、蛋白质氨基酸的分解[7]、美拉德反应[6]、硫胺素降解和微生物作用等，其中脂质的氧化是最重要的形成途径。近年来，对于干腌火腿挥发性风味的研究较为多见，如郇延军等[8]通过对中西方的干腌火腿的风味成分比较为中国火腿的加工工艺的改进提供参考；Wang Wenli等[9]对金华、宣威和如皋火腿的挥发性风味进行全二维气相色谱法分析并讨论了挥发性成分形成的机制，认为火腿香气在个体之间的差异来自于当地环境（如微生物菌群、温度和相对湿度）及原料类型（如年龄和膳食）。但是，对于3 大干腌火腿皮下脂肪的挥发性风味的系统研究甚少，脂肪是干腌火腿挥发性风味的重要前体物质[5]，Tyra等[10]发现原料品种和年龄对火腿皮下脂肪含量有影响；Narváez-Rivas等[11-13]研究了火腿在腌制过程中皮下脂肪挥发性醇类和酯类的含量变化以及醛类和酮类的化学变化，并讨论了将固相萃取与气相色谱-氢火焰离子检测器联用方法应用于火腿皮下脂肪氧化产物的测定。崔莹莹[14]对宣威火腿加工过程中的脂质水解氧化对其风味形成的影响进行了研究；闫文杰[15]优化了金华火腿肌内脂肪和皮下脂肪的提取条件；彭聪等[16]研究了不同成熟时期宣威火腿的风味和营养。而本实验以我国3 个品牌及其不同加工时长的火腿为例，系统地研究其皮下脂肪的挥发性风味物质，探讨影响皮下脂肪风味的关键活性物质。

虽然脂肪是挥发性风味的重要前体物质[5]，但摄入过多的脂肪会影响人体健康，脂肪替代物[17]应运而生，研究火腿皮下脂肪的挥发性风味是脂肪替代物的研发的先决条件。本研究以不同加工时长的金华火腿、宣威火腿和如皋火腿的皮下脂肪为实验材料，采用电子鼻、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）联用方法，对皮下脂肪的挥发性风味物质进行相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），旨在研究并区分干腌火腿皮下脂肪的挥发性香味物质及其变化，以期为全面了解干腌火腿皮下脂肪风味构成及研制脂肪替代物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金华金字火腿、宣威浦记火腿及长寿如皋火腿1 a陈、2 a陈和3 a陈各8 条，分别购自浙江省金华市金字火腿有限公司、云南省宣威市浦记火腿食品有限公司以及江苏长寿如皋火腿有限公司。样品购置后放置于－20 ℃冻库保存。

甲醇（色谱级）、3-甲基丁醛（GC标准品，纯度≥99%）、正构烷烃（C8～C26） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

SCIONSQ-456-GC GC-MS联用仪 美国布鲁克公司；SAAB-5731875 μm CAR/PDMS SPME萃取头 上海安谱实验科技股份有限公司；GM200刀式研磨仪 德国Retsech公司；Fox4000电子鼻 法国Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

取干腌火腿股二头肌整块，剔除腿骨，取皮下脂肪，将处理好的样品真空包装，置于－20 ℃冰箱贮藏备用。实验前将样品在4 ℃过夜解冻，样品解冻后，置放在洁净的操作台上切成1 cm3小块，混合均匀后使用绞肉机将皮下脂肪绞碎。金华金字1 a陈、2 a陈、3 a陈，宣威浦记1 a陈、2 a陈、3 a陈，长寿如皋1 a陈、2 a陈和3 a陈火腿皮下脂肪分别缩写为JH1、JH2、JH3、XW1、XW2、XW3、RG1、RG2和RG3。

1.3.2 电子鼻检测

所用电子鼻共有18 根传感器，分别为LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/Gctl、LY2/Gct、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1和TA/2，每根传感器都有对应的敏感物质类型。将火腿脂肪绞碎，样品放进10 mL的电子鼻专用瓶子并且密封，每个样品为（1.00±0.01）g。可以将样品放入4 ℃低温操作间待检。

电子鼻检测条件根据宋雪[18]的方法稍作修改。电子鼻采集时间为120 s，数据采集周期为1.0 s，数据采集延迟600 s，流量150 mL/min，进样量500 μL，孵化期400 s，孵化温度60 ℃，清洗时间120 s，注射器温度60 ℃，搅拌速率500 r/min，开始搅拌5 s，停止搅拌2 s。

1.3.3 SPME-GC-MS联用技术分析

SPME条件：取5.0 g样品置于20 mL顶空瓶中，对萃取头进行老化，将老化后的萃取头（75 μm CAR/PDMS）插入顶空瓶上部（避免接触样品），在50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取头取出后插入GC进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

GC-MS参数参考郇延军[19]和Petričevića[20]等的方法并稍作修改。采用DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）对挥发性风味物质进行分离，以高纯氦气（流速0.8 mL/min）为载气，进样口温度为250 ℃，不分流，溶剂延迟为1.8 min。GC程序升温条件如下：首先在40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min的速率升温至90 ℃，以10 ℃/min的速率升温至230 ℃保持7 min。质谱条件如下：接口温度250 ℃，离子源温度200 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 33～400。

1.4 数据分析

1.4.1 定性方法

选用C8～C26的正构烷烃，计算挥发性化合物的保留指数，其计算如式（1）所示：

式中：RI为保留指数；Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分别为待测挥发性成分、含n个碳原子正构烷烃及n＋1个碳原子正构烷烃的保留时间。挥发性化合物的定性结合保留指数和NIST2014和Wiley 8.0谱库进行鉴定，仅报道正反匹配度均大于最大值的80%的结果。

1.4.2 定量方法

各种化合物的相对含量采用峰面积归一化法计算。

1.4.3 主体风味评价方法

采用刘登勇等[21]的ROAV法对干腌火腿的主体风味成分进行评价，各化合物的ROAV按式（2）计算：

式中：ROAVi为某挥发性风味物质的相对气味活度值；Ci为某挥发性风味物质的相对含量；Tstan为气味贡献最大挥发性风味物质的阈值；Cstan为气味贡献最大挥发性风味物质的相对含量；Ti为某挥发性成分的嗅觉阈值。

1.4.4 统计分析

所有挥发性化合物数据均采用SAS 9.2软件进行数据统计，并进行方差分析和显著性分析，P＜0.05，差异显著，数据均以表示。电子鼻数据结果经过Statistic 7软件进行分析后采用OriginPro 2017绘制电子鼻PCA图，并采用Excel作雷达图，挥发性化合物PCA采用Canoco5软件处理。

2 结果与分析

2.1 电子鼻数据分析

2.1.1 雷达图

电子鼻中的18 根传感器对样品中一系列挥发性风味物质产生响应，可以表现为指纹信息[22]。

图1 电子鼻检测3 个品牌干腌火腿及3 个加工时长皮下脂肪香气雷达图Fig. 1 Radar plot of E-nose data for discrimination among different brands dry-cured hams of different ages in terms of volatile compounds of subcutaneous fat

如图1所示，3 个品牌干腌火腿虽然原料、产地和加工工艺不尽相同，但同一加工时长火腿皮下脂肪的香气轮廓更接近，这反映了加工时长的累积对干腌火腿挥发性风味的影响。3 种不同加工时长的火腿香味轮廓差异主要集中在P30/2、P30/1、PA/2、T70/2、LY2/Gctl、LY2/GH、LY2/AA、LY2/G这8 根传感器上，表明其对不同种火腿及加工时长的皮下脂肪香气轮廓的区分效果较好。根据喻勇新等[23]的研究可知，这8 根传感器的敏感物质类型包括酮类、碳氢化合物、胺类化合物、二甲苯、碳氧化合物等，导致不同加工时长下3 个品牌火腿的皮下脂肪香气轮廓的差异。

2.1.2 PCA结果

图2 3 个品牌火腿及不同加工时长皮下脂肪电子鼻数据的PCA载荷图Fig. 2 PCA loadings plot of E-nose data for volatile compounds in subcutaneous fat of three brands of dry-cured hams of different ages

电子鼻设备自带的PCA软件可以将18 根传感器采集的数据进行转换和降维，得出的空间分布图可以更好地反映指标信息[24]。如图2所示，判别指数为81，区分度较高，PC1贡献率为96.20%，PC2贡献率为2.30%，贡献率总和为98.50%，大于95%，说明PCA方法适用于3 个品牌干腌火腿皮下脂肪挥发性成分分析，这两个主成分可以代表样品挥发性成分的主要特征。通过比较各组样品的横纵坐标发现，金华金字火腿的3 个加工时长的皮下脂肪的挥发性风味较为接近；XW3挥发性成分在PC1与其他2 个加工时长差异明显，3 种加工时长的长寿如皋火腿皮下脂肪挥发性成分在PC1差异明显。此外，XW3与RG3挥发性风味在PC1中较为接近，二者均为3 a陈火腿皮下脂肪，可能是加工时长对香气和风味特征的影响较大，成熟的火腿显示出较高的风味强度[25]。电子鼻研究结果表明：利用PCA能很好地区分不同品牌和加工时长的干腌火腿皮下脂肪的挥发性风味。

2.2 SPME-GC-MS检测结果

与电子鼻检测的香气指纹相比，GC-MS可以对大量挥发性化合物进行分析。SPME萃取头可以在一定的温度下将样品中的挥发性化合物吸附提取，并在特定的温度下进行释放，经过GC-MS的升温程序将不同的挥发性化合物区分出来，生成总离子流图，再比对GC-MS自带的谱库，将大量的挥发性化合物鉴定出来[26]。

2.2.1 SPME-GC-MS检测挥发性风味物质

采用SPME-GC-MS方法，检测3 个加工时长的金华金字、宣威浦记和长寿如皋火腿皮下脂肪的挥发性风味物质。由表1可知，从金华金字火腿皮下脂肪中检测出56 种风味化合物，包括15 种醛类、8 种酮类、9 种醇类、1 种芳香烃类、8 种酯类、3 种呋喃类、8 种酸类、1 种烃类和3 种其他类。从宣威浦记火腿皮下脂肪中共鉴定得到53 种风味化合物，包括 15 种醛类、7 种酮类、12 种醇类、2 种芳香烃类、5 种酯类、2 种呋喃类、7 种酸类、1 种烃类和2 种其他类。从长寿如皋火腿的皮下脂肪中共鉴定得到57 种风味化合物：包括15 种醛类、8 种酮类、11 种醇类、1 种芳香烃、6 种酯类、3 种呋喃类、8 种酸类、2 种烃类和3 种其他类。3 个品牌干腌火腿皮下脂肪的挥发性风味物质共有62 种，其中醛类16 种、酮类8 种、醇类12 种、芳香烃2 种、酯类8 种、呋喃类3 种、酸类8 种、烃类2 种和其他类3 种。

2.2.2 GC-MS定量结果

如表1所示，各品牌的挥发性化合物的种类和含量都有较大的区别。不同品牌及不同加工时长的干腌火腿皮下脂肪共有的挥发性风味物质包括醛类（3-甲基丁醛、正戊醛、己醛、庚醛、2-己烯醛、辛醛、(E)-2-庚烯醛、壬醛、2,4-己二烯醛、(Z)-2-辛烯醛）、酮类（3-辛烯-2-酮）、醇类（1-戊烯-3-醇、戊醇、3-戊醇和1-己醇）、呋喃类（2-乙基呋喃和2-正戊基呋喃）、酸类（2,2-二甲基丙酸、丁酸和己酸）。其中，2-壬烯醛和γ-戊内酯是金华品牌样品与其他品牌样品之间差异的主要成分，辛醇和1,2-二甲苯是宣威品牌样品与其他样品之间差异的主要成分，十二烷是如皋品牌样品与其他样品之间差异的主要成分。

1 a陈、2 a陈和3 a陈的火腿代表不同加工时长的干腌火腿，如表1所示，火腿的挥发性化合物含量随着加工时长的增加发生了显著变化。产生这些差异的原因可能是温度和水分活度的变化导致火腿皮下脂肪氧化程度的差异[27]，这一点与电子鼻数据结果吻合。正戊醛、苯甲醛、3-甲基-1-丁醇、戊醇、1-己醇、γ-戊内酯、乙酸、丁酸和戊酸含量在金华品牌的3 个加工时长中差异显著，可作为金华金字品牌加工时长评判的依据；同理，戊醇、1-己醇、辛醇和十六酸甲酯，可作为宣威浦记品牌加工时长评判的依据；(E)-2-庚烯醛、(Z)-2-辛烯醛、3-辛烯-2-酮和丁酸可作为长寿如皋品牌加工时长评判的依据。

金华金字火腿、宣威浦记火腿与长寿如皋火腿这3 大干腌火腿不仅原料不同，而且产地和加工工艺也不相同，形成了干腌火腿皮下脂肪的不同挥发性风味。目前，金华火腿与宣威火腿的生产工艺已有国家推荐标准，它们属于地理标志产品，如皋火腿暂无相关标准。干腌火腿的加工工艺中的用盐量及腌制时间各不相同，除此之外，气候条件的差异不容忽视。传统金华火腿依赖自然条件生产[28]，其产地年平均气温17.4 ℃，相对湿度77%[29]；而如皋火腿加工季节是从农历11月至次年2月[4]；宣威火腿腌制最佳时间是当年霜降到次年立春之前[30]。与浙江的金华火腿和江苏的如皋火腿相比较，云南的宣威火腿其加工环境的气候条件更适宜火腿腌制，云南省纬度更低，其产地年平均温度13.3 ℃，平均相对湿度72%[30-31]，可加速火腿皮下脂肪的水解和转化，从而产生挥发性小分子，形成挥发性风味[32]。值得关注的是，近年来我国传统干腌火腿的原料、工艺和气候环境都发生了一定变化。1 a陈、2 a陈和3 a陈的干腌火腿挥发性风味有差异，皮下脂肪中的大部分脂肪酸氧化产物如醛类、酮类和醇类含量随加工时长增加发生了不同变化，反映了在加工时长的累积下，皮下脂肪的氧化程度加深[33]。此外，通过对比先前火腿风味的相关研究[18,34-35]，发现皮下脂肪中很多挥发性风味物质是干腌火腿总体风味中的重要组成成分。

2.3 ROAV鉴定关键性风味物质

干腌火腿皮下脂肪的挥发性风味是由各挥发性化合物的嗅觉阈值与其在风味体系中的浓度共同决定的，为进一步确定干腌火腿皮下脂肪的关键性风味物质，结合表1所示的所有化合物的含量和嗅觉阈值，确定各挥发性化合物的ROAV如表2所示。ROAV可以根据定量的数据和嗅觉阈值提供一种更好的评估方法[36]，它在一定程度上衡量出了在众多的挥发性风味活性物质中对整体风味有重要贡献的物质，ROAV越大，对挥发性风味的贡献越大。在3 个品牌干腌火腿皮下脂肪挥发性风味物质中，己醛含量最多，且阈值只有5 μg/kg，以己醛作为基准物来计算其他挥发性化合物的ROAV，己醛的ROAV为100。表2中共有10 种醛类、1 种酮类、1 种醇类、1 种酯类和2 种呋喃类化合物，它们的ROAV均大于1，对火腿皮下脂肪的挥发性风味有重要贡献。值得注意的是，醛类物质对干腌火腿皮下脂肪的整体风味贡献极大；2-正戊基呋喃和2-乙基呋喃这两种呋喃类物质，对理想香气有重要贡献。

表1 不同加工时长的金华金字、宣威浦记和长寿如皋火腿皮下脂肪香味物质相对含量分析Table 1 Volatile compounds of subcutaneous fat samples from Jinhua, Xuanwei and Rugao hams of different ages

续表1

表2 3 个品牌干腌火腿（3 个加工时长）皮下脂肪香味物质ROAV分析Table 2 ROAVs of volatile compounds in subcutaneous fat from three brands of Chinese hams of different ages

2.4 关键挥发性化合物PCA

为进一步研究不同产地及加工时长对干腌火腿皮下脂肪特征风味的影响，根据ROAV选取的15 种对干腌火腿皮下脂肪挥发性风味有贡献（ROAV＞1）的挥发性化合物进行PCA（图3），在这些挥发性化合物中，己醛具有草本香味，庚醛具有果香味，是脂肪分解自动氧化的副产物[38]。不饱和烯醛如(E)-2-庚烯醛和(Z)-2-辛烯醛等是多不饱和脂肪酸氧化的产物。1-辛烯-3-酮虽然含量低，但其气味阈值只有0.005 μg/kg[37]，ROAV可以达到100以上，可能是不饱和脂质降解产物[39]。这些重要的挥发性化合物以不同的含量比例形成了各具特色的品牌火腿风味。

图3 干腌火腿皮下脂肪及主要挥发性风味成分主成分双标图Fig. 3 PCA biplot for three brands of dry-cured ham in terms of selected volatile compounds in subcutaneous fat

双标分析是一种科学的映射方法，它反映了一系列元素的二维表示及这些元素之间的关系[40]。对经过ROAV分析出的9 种火腿样品的15 种挥发性化合物进行PCA，前两个主成分贡献的总方差为88.01%，PC1贡献的方差为67.82%，PC2贡献的方差为20.19%。在PC1上，JH1和RG3样品的得分最高，均为正值，JH2和JH3正得分仅次于前两者，而XW1、XW2、XW3、RG1和RG2这几类样品的PC1得分都为负值，3-甲基丁醛在PC1上的载荷最大，明显能将JH1和RG3从其他样品中区分开来，而相对较小的2-甲基丁酸乙酯和2-壬烯醛在PC1的载荷能把JH2和JH3区分开来，其他11 种挥发性化合物在PC1的载荷为负，因此这些物质可以区分XW1、XW2、XW3、RG1和RG2这几类样品。其次，在PC2上，JH2和JH3得分为正，再次说明了2-甲基丁酸乙酯和2-壬烯醛的载荷将其与其他样品区分，RG3负得分最高，顺-6-壬烯醛在PC2上的载荷可以将其与其他样品区分。

从整体上看，通过对双标图信息的分析，部分样品可以分别从这两个主成分进行区分，但是有些样品只能通过PC1或者PC2进行区分。这充分体现了双标图的优势[41]。

3 结 论

本实验对3 个品牌干腌火腿的皮下脂肪挥发性风味进行鉴定、分析和区分。基于电子鼻技术可实现对干腌火腿品种和加工时长的快速区分。基于SPME-GC-MS技术分析鉴定出62 种皮下脂肪的挥发性风味物质，结合ROAV筛选出的15 种挥发性风味活性物质，3-甲基丁醛、己醛、庚醛、辛醛、(E)-2-庚烯醛、壬醛、(Z)-2-辛烯醛、2-壬烯醛、6-壬烯醛、(Z,Z)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酸乙酯、2-正戊基呋喃和2-乙基呋喃，它们被鉴定为干腌火腿皮下脂肪中的关键气味活性物质。通过PCA进一步证实了这15 种挥发性风味活性物质可以区分特定火腿皮下脂肪的挥发性风味，其中，3-甲基丁醛能将JH1和RG3与其他样品进行区分，2-甲基丁酸乙酯和2-壬烯醛能区别JH2与JH3，其他11 种挥发性化合物可以区分XW1、XW2、XW3、RG1和RG2。研究结果将为干腌火腿特征挥发性风味物质形成机理的研究以及对研制干腌火腿脂肪替代物提供理论支撑。