温度、pH值对离体模型中肌原纤维蛋白去磷酸化反应的影响

任 驰，侯成立，李 欣，摆玉蔷，张德权*

（中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工重点实验室，北京 100193）

肌原纤维蛋白占宰后肉中蛋白总量的55%～60%，是肌细胞骨架的重要组成部分，与肌肉收缩密切相关，影响宰后肉嫩度[1-2]。蛋白质磷酸化修饰是最为普遍且重要的一种蛋白质翻译后修饰方式[3-6]，在不同嫩度、色泽、pH值下降速率或基因型的宰后肉中鉴定到许多磷酸化蛋白质[7-10]，肌原纤维蛋白存在磷酸化修饰现象[3]。蛋白质磷酸化反应可逆，经磷酸酶催化发生去磷酸化反应。碱性磷酸酶是普遍存在的一种磷酸酶，可对底物分子起到去磷酸化作用[11-13]，在医学、免疫学、生物化学和分子生物学等领域应用广泛[14]。研究表明当宰后肉中蛋白质发生去磷酸化修饰后会正向影响嫩度、肉色等品质[11,15]，通过控制碱性磷酸酶活性降低蛋白质磷酸化水平是一种潜在的方法。酶活性主要受温度和pH值影响，宰后肉在成熟过程中在不同温度下加工、贮藏、运输、销售，而且随着成熟时间延长pH值会逐渐降低到极限pH值后略微回升。因此本实验设置3 个温度及3 个pH值，分别为25（室温）、15 ℃（车间温度）和4 ℃（冷藏温度），pH 5.2（极限pH值）、pH 5.8（介于极限pH值和pH45min的中间pH值）和pH 6.4（pH45min）。通过测定不同温度和pH值条件下酶活性变化及肌原纤维蛋白磷酸化水平变化，明确碱性磷酸酶活性变化规律及其催化去磷酸化反应的能力，为改善和保持宰后肉品质提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择生长环境一致、饲养条件相同且体质量和月龄相近的小尾寒羊与本地羊杂交公羊（7 月龄），屠宰后立即取下双侧背最长肌（n=3），剔除明显可见的脂肪与筋膜，切成大小均一的肉块以便后续取样，待宰后30 min，放入液氮速冻，运回实验室并保存于－80 ℃。采样地点为北京二商穆香源清真肉类食品有限公司，采用清真屠宰方式。

碱性磷酸酶活性测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒 美国Thermo公司；蛋白酶抑制剂 德国Roche公司；三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、5’-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、碱性磷酸酶 美国Sigma公司；Pro-Q Diamond染色液、SYPRO Ruby染色液 美国Invitrogen公司；四硼酸钠、氯化镁、氯化钾、甲醇、乙醇、乙酸、乙腈等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ML204/02电子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；FCR1000-UF-E超纯水机 青岛富勒姆科技有限公司；TS-2型脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；EMS-19磁力搅拌器 天津欧诺仪器仪表有限公司；SpectraMax 190全波长酶标仪 美国Molecular Devices公司；Neofuge高效冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；Research plus微量移液枪 德国Eppendorf公司；MJ-II霉菌培养箱 上海一恒科技有限公司；MSC-100恒温混匀仪 杭州奥盛仪器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System电泳设备、ChemiDocTMMP凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维蛋白提取

参考Huang Honggang等[16]的方法略作修改，取1 g羊背最长肌样品，加入5 mL预冷的肌浆蛋白提取液（0.039 mol/L四硼酸钠，0.025 mol/L KCl，5 mmol/L EGTA，蛋白酶抑制剂），冰浴匀浆15 s（1 200 r/min，匀浆4 次，间隔30 s），将所得匀浆配平后在2 000×g、4 ℃条件下离心15 min，待离心结束后弃掉上清液，在所得沉淀中加入5 mL洗涤液（100 mmol/L KCl，1.0% Triton X-100），在2 000×g、4 ℃离心15 min（2 次）以除去多余肌浆蛋白，弃掉上清液，所得沉淀即为肌原纤维蛋白。在肌原纤维蛋白沉淀中加入10 mL肌原纤维蛋白溶解液（0.4 mol/L KCl、50 mmol/L Tris、1.0 mmol/L DTT），冰浴匀浆15 s。得到的肌原纤维蛋白溶液用BCA法测定蛋白浓度，并保存于－80 ℃。

1.3.2 肌原纤维蛋白孵育

取肌原纤维蛋白溶液，加入碱性磷酸酶纯品（25 U/100 g）建立碱性磷酸酶处理组（AP组），对照组（C组）为不添加碱性磷酸酶的肌原纤维蛋白溶液。孵育条件：25 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育时间10 min、30 min、1 h、2 h、4 h；15 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育时间30 min、2 h、4 h、12 h、1 d；4 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育时间30 min、4 h、12 h、1 d、2 d、4 d。在每个时间点留样，液氮速冻并保存于－80 ℃。

1.3.3 磷酸化水平测定

参照文献[8,16-18]的方法进行肌原纤维蛋白磷酸化水平和碱性磷酸酶磷酸化水平的测定。将50 μL的肌原纤维蛋白溶液与等体积的100 μL上样缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl、pH 6.8、40 g/L SDS、1 g/L溴酚蓝、250 g/L甘油）混合，沸水浴中煮沸5 min，冷却后12 000×g、离心2 min，上清液即为电泳上样样品。电泳采用的分离胶为12%，浓缩胶为4%，上样量5 μg，每个蛋白样品重复4 次。设置初始电压70 V，当溴酚蓝进入分离胶后调至电压110 V，待溴酚蓝跑出分离胶后关闭电源。

电泳结束后，卸下凝胶用固定液（10%乙酸、50%甲醇）固定2 次（30 min/次），水洗3 次（10 min），Pro-Q Diamond染液避光慢摇70 min进行磷酸化蛋白染色，染色完毕后用Pro-Q脱色液（20%乙腈，50 mmol/L乙酸钠，pH 4.0）脱色2 次（30 min/次），水洗3 次（5 min），采用ChemiDocTMMP凝胶成像系统对磷酸化蛋白进行图像扫描。待图像扫描后，用SYPRO Ruby染液避光慢摇5 h进行全蛋白染色，染色完毕后用Ruby脱色液（7%乙酸、10%乙醇）脱色2 次（30 min/次），水洗3 次（5 min），采用ChemiDocTMMP凝胶成像系统对全蛋白进行图像扫描。经Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色后的凝胶在扫描时，激发波长（532 nm）和分辨率（200 mm）一致，但Pro-Q Diamond染色凝胶的发射波长为580 nm，而SYPRO Ruby染色凝胶的发射波长为610 nm[19]。Pro-Q染色后的光密度值（P）和Ruby染色后的光密度值（T）可以采用Quantity One 4.6.2软件进行分析[20]。P/T是计算蛋白质磷酸化水平的一种半定量分析[21]，可以衡量肌原纤维蛋白磷酸化水平和碱性磷酸酶磷酸化水平的变化。用对照组25 ℃孵育0 min时的样品作为标样，消除不同凝胶电泳及染色的差异。

1.3.4 碱性磷酸酶活性测定

采用碱性磷酸酶活性检测试剂盒（货号A059-2）测定AP组的碱性磷酸酶活性。样品稀释1 440 倍后，按照试剂盒说明进行试剂配制，建立反应体系，充分混匀后在不同的孵育温度（25、15、4 ℃）反应15 min，加入显色液，轻轻振摇孔板混匀，用酶标仪在波长520 nm处测定吸光度，平行4 次。碱性磷酸酶活性计算公式如下：

1.4 数据统计分析

用SPSS Statistic 21.0软件进行数据分析。肌原纤维蛋白磷酸化水平、碱性磷酸酶磷酸化水平、碱性磷酸酶活性用独立样本T检验和邓肯多重比较法进行差异显著性分析，P＜0.05，差异显著，结果用表示。

2 结果与分析

2.1 肌原纤维蛋白磷酸化水平

图1 不同温度、pH值孵育Pro-Q染色和Ruby染色图Fig. 1 Pro-Q and Ruby staining images of SDS-PAGE gels at different temperatures and pH values

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光染色分析不同温度、pH值条件下随着孵育时间延长肌原纤维蛋白磷酸化水平变化，结果如图1、2所示。从图1中选取10 个清晰且明显可见的电泳条带进行光密度分析，每个时间点Pro-Q染色10 个条带光密度的和（P）与Ruby染色10 个条带光密度的和（T）之比为肌原纤维蛋白磷酸化水平。

图2 不同温度、pH值孵育肌原纤维蛋白磷酸化水平Fig. 2 Phosphorylation levels of myofibrillar protein at different temperatures and pH values

蛋白质经磷酸酶催化可以发生去磷酸化反应，降低蛋白质磷酸化水平[22-24]。由图2可知，随着孵育时间的延长，在不同温度和pH值条件下C组的肌原纤维蛋白磷酸化水平均无显著变化（P＞0.05），说明不添加碱性磷酸酶的肌原纤维蛋白在孵育过程中不发生去磷酸化反应。pH 6.4条件下，25 ℃孵育4 h AP组肌原纤维蛋白磷酸化水平为0.72，显著低于此时C组肌原纤维蛋白磷酸化水平0.95（P＜0.05）；15 ℃每个孵育时间AP组肌原纤维蛋白磷酸化水平显著低于C组肌原纤维蛋白磷酸化水平（P＜0.05）；4 ℃孵育4 d AP组肌原纤维蛋白磷酸化水平为0.96，显著低于C组肌原纤维蛋白磷酸化水平1.13（P＜0.05），说明在pH 6.4时温度高有利于碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应。pH 5.8条件下，25、15、4 ℃孵育4 h、1 d、4 d AP组肌原纤维蛋白磷酸化水平分别为0.78、0.83、0.95，显著低于C组肌原纤维蛋白磷酸化水平0.99、0.97、1.16（P＜0.05），说明pH 5.8时温度高同样有利于碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应。pH 5.2条件下，不同温度AP组的肌原纤维蛋白磷酸化水平也未发生显著变化（P＞0.05），说明pH 5.2条件下碱性磷酸酶活性被抑制。对比相同温度不同pH值结果表明，pH值高有利于碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应。

综上，碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白去磷酸化反应受温度和pH值的共同调控，但当温度或pH值中某一因素更加偏离碱性磷酸酶发挥最大活性的条件时，会成为影响碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白去磷酸化反应的限制因素。

2.2 碱性磷酸酶活性

碱性磷酸酶来源不同其理化性质也存在一些差异[25]，碱性磷酸酶发挥活性的最适pH值在9～10左右，最适温度在40 ℃左右[26-30]。如图3所示，随着孵育时间的延长碱性磷酸酶活性逐渐下降。25 ℃，pH 5.8和pH 6.4孵育1～4 h的碱性磷酸酶活性为15 103.03～16 123.91 U/L，显著大于pH 5.2孵育1～4 h的碱性磷酸酶活性（P＜0.05），说明25 ℃、pH 5.2抑制碱性磷酸酶活性，使得此条件下碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化程度低，肌原纤维蛋白磷酸化水平较对照组无显著变化（P＞0.05）。15 ℃，pH 6.4孵育30 min、12 h、1 d碱性磷酸酶活性显著大于pH 5.2和pH 5.8孵育30 min、12 h、1 d碱性磷酸酶活性（P＜0.05），说明当温度下降时，pH值降低对碱性磷酸酶活性的抑制作用增强。4 ℃、pH 5.2条件下，碱性磷酸酶活性在孵育至第2天时最高为12 889.27 U/L，说明随着孵育时间延长，4 ℃、pH 5.2的条件对碱性磷酸酶活性抑制作用会随着孵育时间延长而减弱。

比较不同温度下，同一pH值和孵育时间的碱性磷酸酶活性，如图3所示，在同一pH值和孵育时间下，温度降低抑制碱性磷酸酶活性，说明温度偏离碱性磷酸酶最适温度越大对碱性磷酸酶活性抑制越强。但15 ℃、pH 5.8孵育2 h和4 h以及15 ℃、pH 6.4孵育30 min的碱性磷酸酶活性稍大于25 ℃同样条件下的碱性磷酸酶活性，说明此条件下25 ℃和15 ℃对碱性磷酸酶活性抑制作用相差不大。

图3 不同温度、pH值孵育碱性磷酸酶活性Fig. 3 AP activities at different temperatures and pH values

2.3 碱性磷酸酶磷酸化水平

图4 不同温度、pH值孵育碱性磷酸酶磷酸化水平Fig. 4 Phosphorylation levels of AP at different temperatures and pH values

本实验中所用的碱性磷酸酶（货号P0114）分子质量为140～160 kDa。碱性磷酸酶是一种同源二聚体磷酸单酯酶，在制备用于电泳样品时会使碱性磷酸酶发生变性，二聚体解体后分子质量约为70 kDa[30]，如图1 AP条带所示。在孵育过程中碱性磷酸酶磷酸化水平出现显著变化，结果如图4所示。随着孵育时间延长，不同温度和pH值条件下的碱性磷酸酶磷酸化水平逐渐下降，说明碱性磷酸酶不仅可以催化孵育体系中的肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应，也能催化其自身发生去磷酸化反应。25 ℃孵育10 min时pH 5.2和pH 6.4条件下的碱性磷酸酶磷酸化水平差异显著（P＜0.05），15 ℃孵育30 min pH 5.2和pH 6.4条件下的碱性磷酸酶磷酸化水平差异显著（P＜0.05），而4 ℃孵育4 h pH 5.2和pH 6.4条件下的碱性磷酸酶磷酸化水平差异显著（P＜0.05），说明温度升高会使碱性磷酸酶催化其自身发生去磷酸化反应的时间提前。不同温度在孵育后期pH 5.2条件下的碱性磷酸酶磷酸化水平显著高于另外2 个pH值条件下的碱性磷酸酶磷酸化水平（P＜0.05），说明即使温度升高，pH 5.2对碱性磷酸酶催化其自身发生去磷酸化反应的抑制作用也更强烈。这是由于pH 5.2对碱性磷酸酶活性抑制作用明显。通过比较不同温度和pH值条件下的碱性磷酸酶活性与碱性磷酸酶磷酸化水平发现，限制碱性磷酸酶活性变化的主要因素是温度和pH值。当碱性磷酸酶发生去磷酸化后，其活性会略微下降，但影响碱性磷酸酶活性的因素主要是温度和pH值。

3 讨 论

磷酸化修饰是一种普遍的蛋白质翻译后修饰方式，近年研究表明宰后肌肉中存在蛋白质磷酸化修饰，并对肉品质的形成产生一定影响[20,31]。蛋白质磷酸化反应是一种可逆反应，在磷酸酶的催化下会发生去磷酸化反应，降低蛋白质磷酸化水平。有研究表明，碱性磷酸酶活性受温度和pH值的影响[25]，进而影响到其催化去磷酸化反应的能力。本研究结果表明碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应，肌原纤维蛋白磷酸化水平降低，与前人研究结果一致[15,32]。本研究发现随着孵育温度和pH值的升高，肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应的程度增大，时间提前，这可能和碱性磷酸酶活性受到不同温度和pH值的影响有关。Bortolato等[33]研究表明，低温下酸性pH值会抑制碱性磷酸酶活性，这与本研究温度、pH值越低碱性磷酸酶活性越小相一致。pH 5.2接近宰后肉的极限pH值[34]，在此条件下即使孵育温度升高碱性磷酸酶也不能显著降低肌原纤维蛋白磷酸化水平，说明此时碱性磷酸酶活性已被抑制。本团队研究表明[35]，宰后羊肉在4 ℃贮藏磷酸化水平先升高后逐渐降低，并在贮藏5 d时达到稳定，这可能是因为宰后ATP消耗殆尽，磷酸化反应结束，而达到极限pH值后，去磷酸化反应受抑制，故磷酸化水平逐渐稳定。前人研究表明，碱性磷酸酶长时间处于pH 3.4或40～70 ℃的条件会使α-螺旋受到破坏，二级结构逐渐消失，发生不可逆的失活[36]。

通过分析碱性磷酸酶的磷酸化水平，发现碱性磷酸酶可以催化自身发生去磷酸化反应，这可能与碱性磷酸酶是一种非特异性酶有关[30]。本研究发现，碱性磷酸酶磷酸化水平变化趋势比碱性磷酸酶活性和肌原纤维蛋白磷酸化水平明显，说明当碱性磷酸酶自身发生去磷酸化后，对碱性磷酸酶活性没有决定性影响。例如，在pH 5.2条件下，3 个温度孵育时碱性磷酸酶磷酸化水平均变化显著，但碱性磷酸酶活性变化相对稳定，肌原纤维蛋白磷酸化水平较对照组无显著变化。推测碱性磷酸酶自身发生去磷酸化对其二级结构的影响小于温度和pH值，这有待进一步验证。

4 结 论

本研究发现碱性磷酸酶不仅可以催化其他蛋白发生去磷酸化，也可以催化其自身发生去磷酸化。而且当碱性磷酸酶自身去磷酸化后，对碱性磷酸酶活性影响较小，影响碱性磷酸酶活性的因素主要是温度和pH值。当pH值较低时，碱性磷酸酶活性被抑制程度高，不能降低肌原纤维蛋白磷酸化水平。在一定范围内，温度和pH值升高可以使碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白去磷酸化能力增强，作用时间提前，这为通过降低宰后肉中磷酸化水平而改善肉部分食用品质提供理论依据。