高压液相色谱仪测定HbA2 HbF的影响因素分析

张奇 沈阳市铁西区卫生健康服务与行政执法中心（沈阳市铁西区疾病预防控制中心） （辽宁 沈阳 110021）

内容提要： 目的：探究高效液相色谱仪测定HbA2/HbF的影响因素的定性定量指标。方法：选取40例血红蛋白病检测样本。根据采集顺序的不同，将其分为1、2两个组进行有效研究。测定人全血中HbA2/HbF的百分含量。并结合实际情况，分析洗脱时间，峰形的测值的影响因素。使用D-10 Dual Program仪器的地中海地贫模式，采用高效液相色谱仪测定（HPLC）方式检测。一组使用直接上样的方式，另外一组使用的是血红蛋白液上样。结果：样本条件的影响，一部分全血使用的是全血上样的模式1:300的比例稀释，一部分是以1:200比例稀释样血红蛋白液的模式进行上样，进行分析。检验证明，1:200的比例的血红蛋白上样中，上样分析效果明显优于1:300的比例的全血样本。以上检验需要控制面积需要保持在100000～4000000μvolt.范围内，避免堵塞情况呈现。并且峰值过饱和情况的检测是不精确的，需用碱变性试验进行验证，或者需倍比稀释或梯度稀释样本再行测定。异常血红蛋白病的峰形图会有特征性变化，比如：时间处于0.37min的时候，unknown的数值，血红蛋白S-Window值等就会呈现。两组资料的基本情况无明显差异（P＜0.05）。结论：样本稀释度的大小，直接影响了地中海贫血模式横扫面积，并影响了HbA2/HbF的测定值。峰值过饱和的情况下，需用碱变性法进行验证。并且对异常血红蛋白病峰形的观察，可以对地贫基因的探究起到一个较好的提示性作用。

近年来，高效液相色谱仪测定（HPLC）技术不断进步，其中，HbA2定量分析是目前被广泛认可的检测技术。本文按照HbA2/HbF的标准化进行探究，主要分析HPLC检测中容易被忽视的影响因素[1]。探究全血中HbA2/HbF的百分量，使用在D-10Dual Program 仪器地中海贫血模式，利用高效液相色谱仪测定，对上样样本制备，观察分析洗脱的时间与血红蛋白峰形，影响结果的相关干扰因素，进而进行有效对比分析[2]。

1.资料与方法

1.1 临床资料

选取40例血红蛋白病检测样本。根据采集顺序的不同，将其分为1、2两个组进行有效研究。测定人全血中HbA2/HbF的百分含量。并结合实际情况，分析洗脱时间，峰形的测值的影响因素。使用D-10 Dual Program仪器的地中海地贫模式，采用HPLC方式检测。一组，使用直接上样的方式，另外一组使用的是血红蛋白液上样。两组资料的基本情况无明显差异（P＜0.05），本次研究具有可比性。

1.2 方法

此次样本人员在探究的样本构建之前，需要进行样本前的处理。1组直接上样，2组血红蛋白液上样。其中，血红蛋白的制备过程，主要以生理盐水清洗方式3次，然后取压积红细胞，接着按照比例加入等量的双蒸水，摇匀。再加上1/2的四氯化碳，在混合震荡的情况下保持1min，静止10min[3]。这个时候的离心率2000r/min，需要保持15min以上，接着吸取上清液，就可以提取到大约10%左右的血红蛋白液。样本处理好了之后，就需要进行HbA2/HbF定量测定[4]。接着利用HPLC的方式，一个部分是1:200的比例，血红蛋白上样，一个部分是1:300的比例，直接上样，按照参照对比的方式，分析HbA2/HbF的数值，进行平行分析。这个时候就可以根据实际情况，探究洗脱的时间与血红蛋白峰形，对影响结果的相关干扰因素进行有效对比分析[5]。

1.3 观察指标

探究高效液相色谱仪直接上样与血红蛋白液上样中，洗脱的时间与血红蛋白峰形，影响结果的相关干扰因素进行有效对比分析。

1.4 统计学分析

使用SPSS 23.0软件对研究得到的数据进行统计处理，得到的统计数据用±s来进行表示，用t来对计量资料检验，计数资料的检验则通过χ2，P＜0.05为差异具有统计学意义[6]。

2.结果

1组与2组样本直接上样与血红蛋白液上样HPLC法检测结果对比中1组有9例患者结果峰面积高于或者低于在100000～4000000μvolt.范围内。然而，2组上样的结果峰面积全部控制在100000～4000000μvolt.范围内，符合标准化的要求。因此，对样本条件的影响，35例中是1:200的比例，一个部分是1:300的比例，接着使用直接上样和血红蛋白上样的形式，进行分析。检验证明，1:200的比例的全血样本中，上样分析效果明显优于1:300的比例的全血样本，见表1。

表1.1组与2组样本直接上样与血红蛋白液上样HPLC法检测结果对比(n)

3.讨论

针对于随机40例的全血样本取样中，按照时间的顺序，分为1、2两组，1组直接上样，2组血红蛋白液上样。首先，样本条件的影响中，分别使用是1:200的比例和1:300的比例进行上样，换句话说就是使用血红蛋白上样和直接上样的形式，进行分析，控制面积需要保持在100000～4000000μvolt.范围内，避免堵塞情况呈现。结果发现，1:300的比例的全血样本，由于年龄的不同，很容易出现堵塞吸样孔及标本的情况出现，这样就不符合上样的峰面积需求。1:200的比例的血红蛋白液上样，就符合上样的峰面积要求。这样就可以更好、更全面地诊断血红蛋白病。检验证明，1:200的比例的血红蛋白上样中，上样分析效果明显优于1:300的比例的全血样本。其中有3例测量不出HbF值，需要在碱性的控制范围上进行测定。经过以上1组与2组的实验可以发现，经前处理的血红蛋白液上样的样本，比直接上样的精确率更高。并且峰值过饱和事后的检测是不精确的，需用碱变性试验进行验证或者，需倍比稀释或梯度稀释样本再行测定。由此，HPLC在检测HbA2/HbF的定量指标时的干扰因素的时候，需要根据样本的稀释度，样本的年龄大小，峰形的图形等进行有效的分析，这样才能提升基因分析，保证确诊率，实现有效验证。