单细胞转录组测序及其在肾脏疾病研究中的应用进展

杨明鑫， 魏鸿擎， 谢静远

[1.上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏内科，上海200025；2.上海交通大学医学院肾脏病研究所，上海 200025；3.晶能生物技术（上海）有限公司，上海 200235]

肾脏疾病的机制复杂，部分原因在于肾脏组织具有大量不同的、高度分化的细胞类型，这为肾脏病机制研究带来困难。传统的RNA测序方法，只能获得所取组织基因表达的平均水平，无法获知单个细胞的种类和状态，而单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）可以从单个细胞的水平得到基因表达图谱，从而对异质性的组织样本进行分群鉴定，在疾病研究中有着很好的应用前景，是近年来发展很快的一项技术。单细胞转录组测序可以区分不同的细胞类型，并了解其基因表达，为探索肾脏疾病的发病机制、发现新的治疗靶点提供思路，该技术还可以应用于肾脏活检，使得肾脏疾病诊疗个体化、精准化[1]。本文主要介绍现有的单细胞转录组测序技术，及其在肾脏领域中的进展和应用前景。

scRNA-seq技术的发展

一、特定细胞亚群的基因表达检测技术

目前的肾脏转录组研究大多使用表达谱芯片（microarray）或二代RNA测序技术（bulk RNA-seq），检测出的基因表达水平是所有细胞的平均值。为了分析特定细胞亚群的基因表达情况，可以使用细胞分离技术，包括显微分离、荧光细胞分选技术、激光显微切割捕获技术等手段进行组织分离。如Lee等[2]使用显微切割的方法得到了大鼠的14个肾小管节段，并应用二代RNA测序分析了每个节段的基因表达。Tong等[3]在显微镜下分离局灶节段性肾小球硬化患者的肾小球，进行芯片转录水平检测，发现膜金属内肽酶的表达较对照组有显著差异。以上方法可获得特定组织的基因表达信息，不过无法得到单个细胞的转录信息。

二、单细胞分离技术和高通量测序技术推动scRNA-seq测序技术

近十年来，微流控芯片、微液滴、微孔板技术，以及使用毛细管、磁体、电场或冲孔探针自动收集细胞等，为单细胞分离提供了诸多方法[4]，加上高效的基因扩增技术的发展，使得高通量scRNA-seq成为可能。自2009年Tang等[5]首次应用scRNA-seq，2012年Fluidigm公司推出了世界上第一款单细胞RNA测序自动化系统，其后，单细胞分离及测序流程得到了进一步改进，相关研究也在如火如荼的进行。2017年，多国科学家倡议提出的人类细胞图谱计划[6]，就是基于scRNA-seq技术来构建人类的细胞表达图谱。

scRNA-seq主要过程为，将组织或细胞制备成单细胞悬液，裂解细胞、捕获其中的RNA，反转录为cDNA，同时加入单个细胞特异的DNA标签，扩增cDNA并建立RNA-seq高通量测序库。scRNA-seq的关键步骤在于单细胞悬液的制备和单细胞的分离和标记。目前的单细胞分离方法主要有2种，分别是微孔板和微液滴途径，微孔板途径可使单个细胞分散在单个微孔中，并加以标记；微液滴途径则是通过构造精细的微液滴，来分离识别单个细胞[1]。

1．单细胞分离途径

（1）微孔板途径：微孔板途径通过将单个细胞分散到微孔板，再进行标记和测序。2012年问世的STAT-seq是最早的微孔板方法，其将细胞分散到96孔板上，反转录时在cDNA的一端加入寡核苷酸标志物，这样一次可以测96个细胞。其后，SMART-seq等技术相继问世。早先的微孔板途径成本较高，建库成本每个细胞为5～10美元。随着技术的进步，Fluidigm公司开发了单细胞捕获和制备平台Fluidigm C1系统，利用微流体芯片分离单细胞到微孔板，可同时检测800个细胞，提高了不同微孔板技术检测的细胞数量。不过由于该系统的细胞采集孔为固定大小，对采集细胞的大小有偏倚。2017年，改进后的STRT-seq-2i技术使用了9 600微孔阵列平台，成本进一步降低[7]。微孔板途径的新方法也不断涌现，如依靠重力将单个细胞沉降在微孔中[8-9]；以及通过4种标记的排列组合，一次标记高达千万数量级的细胞[10]。这些新技术使得单个细胞测序的成本大大降低，但由于该技术操作要求高，自动化程度低，仍难以推广。但商业化的测序平台简化了操作流程，如BD公司的BD Rhapsody单细胞分析系统就是其中代表。

（2）微液滴途径：微液滴途径近几年更为流行，其通过仪器构建复杂精细的微液滴，进行单细胞转录组分离识别，可以一次检测成千上万个细胞。该技术利用带有独特标记的磁珠，与单个细胞结合形成单个液滴，细胞裂解后，磁珠上的标志物与释放的mRNA杂交，反转录成为带有标记的cDNA，之后构建测序文库。2015年发布的DropSeq技术最先采用该方法，实现了高通量和低成本，但细胞捕获率只有大约5%。与DropSeq同时发布的InDrops方法则可捕获60%～90%的细胞，适用于细胞数量少的样本。随着商业化测序平台10×Genomics公司的10×Chromium问世，微液滴途径得到了推广普及，并且由于其成本低、通量高的特点，成为主流scRNA-seq技术之一。10×Chromium包括了一整套设备和试剂，可以快速标记100～80 000个细胞，捕获率高达65%，成本为每个细胞0.15~1.00美元。10×Chromium平台与上文的BD Rhapsody平台不分伯仲，是目前主流的scRNA-seq方法。

二、文库构建与细胞识别

进行细胞的转录组测序需要构建测序文库，而建立测序文库的扩增方法主要是聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）和体外转录，PCR的优点是速度很快，但属于非线性扩增，即不同的片段扩增倍数不同，且易形成引物二聚体和其他产物；体外转录则更加严格、准确，是线性扩增，但过程较慢。UMIs（unique molecular identifier）是在文库扩增前，用随机碱基序列标记每个mRNA片段，在后期分析中可减少PCR的扩增偏倚。大部分技术扩增RNA的3′端或者5′端，不能反映全长，而SMART-seq等技术则可捕捉RNA的全长。

三、数据分析

scRNA-seq得到的数据可以进行多种分析，最常见的是无监督聚类分析，其依照细胞的基因表达不同将细胞分为不同的群体；还可进行差异基因筛选分析、基因相互作用、转录因子网络分析、伪时间排序、分支分析等[1]。由于scRNA-seq技术打乱了细胞的空间结构，并不知道测序细胞的来源和位置，数据分析时可根据特征基因的表达，判断细胞种类和来源。如Kdr基因可用于识别内皮细胞，Nphs1和Nphs2基因可识别足细胞,Slc12a3基因可识别远曲小管等[11]。

可见，scRNA-seq方法的更新换代速度很快，不同方法在测序通量和质量、细胞大小、处理细胞数量等存在不同，需要仔细考虑方法的适用性和局限性、实验的细胞种类、数目、不同细胞的表达相似程度及测序成本等，而对于相似的细胞类型，可能需要更高分辨率的技术来区分基因表达差异[12]。

表1 以往研究中肾脏scRNA-seq情况

scRNA-seq技术在肾脏疾病研究中的应用

目前，scRNA-seq已在细胞发育与分化、肿瘤、干细胞、免疫细胞、神经细胞等获得了巨大的进展。scRNA-seq技术在鉴定细胞亚型、发现新的细胞种类，进而探究新的分子机制具有重要作用（见表1）。

一、细分细胞亚型

1.小鼠肾组织细胞RNA表达研究：scRNA-seq能够以细胞为单位构建细胞特异性表达图谱，从而发现不同细胞间的RNA表达差异，为探索肾脏发育及肾脏疾病机制提供新的方法。如肾脏发育方面，Brunskill等[13]利用单细胞捕获和制备平台Fluidigm C1系统对小鼠早期肾脏进行scRNA-seq检测，建立了肾脏发育中的细胞表达图谱。而为了探索肾小球细胞的基因表达情况，Lu等[14-15]对肾小球的足细胞和系膜细胞进行scRNA-seq检测，用磁珠法[16]分离小鼠的肾小球，同样通过Fluidigm C1平台进行scRNA-seq检测，找到了92个足细胞相关基因，并通过siRNA沉默对其中37个新发现的基因进行功能探究，发现其大多与足细胞骨架相关。不过可能因为技术所限，该研究仅测了20个足细胞。该研究对系膜细胞的分析则发现，既往认为特异性表达于系膜细胞的基因并非在所有系膜细胞中均表达。Chen等[17]使用流式细胞荧光分选技术获取小鼠集合管的主细胞和闰细胞，并对其进行scRNA-seq检测，得到了主细胞、A型和B型闰细胞的转录组数据，建立了集合管基因表达数据库。该研究发现，很多信号通路的受体和配体分别在集合管的不同细胞中表达，如Notch2分子主要在主细胞表达，而其配体Jag1主要在闰细胞中表达，提示这些细胞间存在信号的交互。

既往研究获得的足细胞数量很少，而近年的研究显示，采用特定方法可以获得较大数量的足细胞[18]。该研究对8只小鼠的肾脏用磁珠法提取了肾小球[16]，使用DropSeq测序，获得了大约13 000个单细胞数据，其中足细胞占80%，系膜细胞占2%，内皮细胞占12%。同时还发现消化方式会影响足细胞、系膜细胞、内皮细胞丰度，而对肾小管上皮细胞影响较小。

2.人肾组织scRNA-seq研究：scRNA-seq技术目前已用于人肾组织，推动肾病发病机制及肾移植的研究，如能进一步应用于病理诊断，将有助于建立新的精准肾脏病理分型。Der等[19]对系统性红斑狼疮肾炎患者的皮肤和肾活检样品使用Fluidigm C1进行scRNA-seq检测，在肾小管细胞中发现，干扰素诱导相关的基因与疾病严重程度相关。有趣的是，在患者的皮肤样本中亦发现该基因表达上调，提示通过皮肤等容易获得的组织进行scRNA-seq检测，可以反映系统性红斑狼疮肾炎患者肾脏损伤的情况。该研究虽然未能鉴别出足细胞和系膜细胞，但首次在人的肾活检组织中尝试使用scRNA-seq技术。近年来，Wu等[20]对出现混合型排异反应的移植肾活检组织进行scRNA-seq检测，共测序了4 487个细胞，确认了16个细胞群，包括肾小管细胞、淋巴细胞和白细胞以及间质细胞、内皮细胞和活跃增殖细胞。研究者发现，排异反应中的内皮细胞根据基因表达不同分为3种状态——静息状态、血管源性状态和免疫球蛋白吞噬状态，其中第三种状态表达Fc受体激活通路和抗体内化相关基因，符合抗体介导排异反应的病理诊断，将既往发现的排异反应相关基因精准定位到了特定细胞亚群。该研究提示了scRNA-seq检测在移植肾活检中的应用潜力，有望建立更精准的基于细胞分子分型的肾脏病理诊断体系。

对肾脏活检组织进行scRNA-seq检测目前仍存在挑战。首先，肾活检组织比较少，需要更高的细胞捕获率；其次是患者肾组织病理类型不能预先判断，不易对特定肾脏病理患者群体行scRNA-seq检测。理想状态是将肾组织储存起来，而不改变细胞活力或表达模式，现已有组织保存后行scRNA-seq的报道。Thomsen等[21]使用一种称为FRISCR的方法来固定、染色、分选细胞，以甲醛固定细胞，保存在-80℃，并以此方法对大脑放射状胶质细胞进行了scRNA-seq检测。Alles等[22]用甲醇固定细胞，以人胚肾细胞和小鼠胚胎细胞、小鼠神经细胞等为对象，并证实其可以保存细胞数周，而对测得的单细胞数据损失不大。Attar等[23]提出了一种专为scRNA-seq检测保存细胞的方法，通过使用3，3′-二硫代丙酸二（N-羟基丁二酰亚胺酯）试剂固定保存细胞，并在慢性髓系白血病细胞系上应用。

二、发现新的肾脏细胞种类

应用scRNA-seq不仅可以识别复杂的肾脏细胞类型，还可以发现新的细胞种类。最近，Park等[11]以10×Chromium系统对7只成年健康雄性小鼠肾脏进行测序，利用聚类分析将细胞分为21个细胞群，鉴定其中3个为新的细胞种类。他们探究了其中一种新的细胞群，此细胞群同时含有主细胞和闰细胞的标志物，也有独特的基因标志物如Syt7等，通过构造可以调控Notch基因表达的小鼠模型，证实在成年小鼠中该类细胞是闰细胞到主细胞转化的中间过渡形态，由Notch信号调控，研究者将其命名为过渡细胞（transitional cell），并进一步研究其在疾病中的作用，构建了叶酸诱导的CKD小鼠模型，通过bulk RNA-seq，发现CKD小鼠的主细胞表达增多，而闰细胞表达减少，存在闰细胞向主细胞转换的趋势。对高血压、糖尿病性CKD患者的肾活检组织样本进行bulk RNA-seq分析，亦发现患者的肾组织存在主细胞/闰细胞比例升高。由于闰细胞与泌酸功能相关，同时在叶酸诱导的CKD小鼠模型中观察到了血浆CO2水平升高，故推测闰细胞向主细胞转换的过程可能与代谢性酸中毒相关。除了鉴别新的细胞，scRNA-seq技术还可以识别细胞的来源。例如，既往对肾脏成纤维细胞的来源有争议，Kramann等[24]采用单侧输尿管梗阻的小鼠模型，分离出肌成纤维细胞，通过进行scRNA-seq检测，发现肾脏肌成纤维细胞主要来自驻留的周细胞，少部分来自循环来源的单核细胞。

问题与展望

目前，scRNA-seq面临诸多挑战。首先是单个细胞RNA量很少，平均每个细胞只有10 pg的RNA，仅 0．1 pg为mRNA，需要进行高效扩增后再测序。目前的研究报道，一般每个细胞测得的基因数目为800个左右，而大部分细胞含有5 000～10 000个基因[12]。其次是单细胞的分离对RNA的影响。细胞的分离采用的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等大多在37℃孵育，分离过程会使得细胞处于应激状态，从而改变部分基因表达。有研究发现，小鼠肾脏37℃消化15 min后，某些早期即时反应蛋白的表达量可增高到1 000倍[25]。为了解决该问题，可以进行单个细胞核的RNA seq检测[26-27]，但该方法也有内在不足，细胞核中只有10%～20%的RNA，大部分RNA分布在细胞质中，且细胞核中也有尚未剪除内含子的RNA，使分析变得复杂。另外，核RNA含量是否能反映细胞质RNA也有争议。其他减少细胞分离过程中应激反应的办法还包括使用转录抑制剂[28]或使用嗜冷菌蛋白酶。如Adam等[25]以嗜冷菌提取的蛋白酶，在6℃对小鼠肾脏进行单细胞分离，并行scRNA-seq检测，与37℃解离细胞相比，大大减少了测序失真。

另外，肾脏组织的特殊结构使得肾脏细胞分离比较困难。如足细胞通过足突附着于肾小球毛细血管，而系膜细胞更是深埋在肾小球内部，难以解离。此外，在解离过程中部分细胞容易死亡，导致得到的结果产生偏倚。因此，肾组织的scRNA-seq检测有待细胞解离方法的进展。虽然，scRNA-seq检测在肾脏领域应用较晚，但相关研究逐渐增多，使我们能更好地理解肾脏疾病的发生、发展，并且有潜力替代目前的病理诊断，使肾脏疾病治疗个体化、精准化。