阴阳离子交换树脂串联纯化海藻甜菜碱的工艺研究

李辰，吴家强，徐学涛，梁健欣，梁春婵

（1.五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门 529020；2.广东杰士农业科技有限公司，广东 江门 529000）

我国海藻资源丰富，利用海藻资源开发的海藻肥是一种生态、环保、高效的新型生物肥，具有广阔的应用前景[1].甜菜碱是海藻的主要功能成分之一，具有保护肝脏、降血脂、抗氧化、提高免疫力等作用[2-4]，可作为制药工业的原料.甜菜碱的季胺盐结构使其具有抗高盐和抗干旱的能力，可作为植物生长调节剂中的主要活性物质之一[5-7]，也是评价海藻肥品质的关键成分[8].甜菜碱还具有保湿功能，它在水溶液中极易形成氢键，其特性粘度和表观比重远高于甘油，可用作保湿护肤品.此外，甜菜碱本身所携带的氨基和羧基使其成为一种两性离子表面活性剂.甜菜碱的分析方法主要有比色法[5]、非水滴定法、重量法等，大型仪器分析方法主要有薄层扫描法、高效液相色谱法[9-10]、液相色谱-质谱联用法[11-12]等，但大型仪器检测方法价格昂贵，且样品前处理繁琐、分析流程较长、对操作技能要求高，本文采用紫外法检测甜菜碱含量.目前，以阴阳离子交换树脂联用提高海藻提取物中甜菜碱纯度的方法鲜见报道.本文以我国南海海域马尾藻为研究对象，初步考察了海藻中甜菜碱的提取分离纯化工艺，以期提高海藻的资源利用率.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV5100紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BSA224S-CW电子分析天平（赛多利斯）；QE-50粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；SHA-L恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）；ZNCL-BS磁力搅拌器（杭州瑞佳精密仪器公司）；TD5A-WS离心机（湖南湘仪）；RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣）.

1.2 试剂与材料

甜菜碱标准品（广州分析测试中心科力技术开发公司，批号ZBW110894）；雷氏盐（四硫氰基二氨合铬酸氨，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醚、丙酮、氢氧化钠和盐酸均为分析纯，广州化学试剂厂；氯化钠，分析纯，天津百世化工有限公司；氨水，分析纯，汕头西陇科学股份有限公司；无水乙醇，分析纯，广州金华大化学试剂有限公司.

海藻原料2016年采自中国南海，由华南农业大学谭志远教授鉴定为马尾藻属（Scagassum），样本存放于广东杰士农业科技有限公司样品室.由于海藻表面附着有盐等杂质，故需先充分洗涤除去盐分及泥沙，再置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，经粉碎机粉碎，过60目筛后密封保存备用；D101和AB-8大孔吸附树脂（郑州勤实科技有限公司）；732和717离子交换树脂（国药集团化学试剂有限公司）.

2 实验方法

2.1 甜菜碱的测定方法

参照文献[5]方法进行甜菜碱含量检测.

2.2 溶液配制

1）甜菜碱标准溶液a（约1.00 mg/mL）：准确称量0.1000 g甜菜碱标准品，溶于蒸馏水中，转移到100 mL容量瓶中，定容，用于绘制标准曲线；甜菜碱标准溶液b（10.00 mg/mL）：准确称量甜菜碱标准品0.1000 g，用适量去离子水溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀，即为10.00 mg/mL的甜菜碱标准品溶液，用于树脂吸附和解吸附实验.

2）雷氏盐饱和液（15.00 mg/mL）：准确称量1.5000 g雷氏盐，加入适量蒸馏水，用搅拌器搅拌溶解45 min，过滤后用浓盐酸酸化到pH值为1.0（雷纳克酸季胺化合物在pH=1.0时，沉淀最完全），蒸馏水定容至100 mL容量瓶，用于沉淀季胺化合物，此试剂须现用现配.

2.3 甜菜碱的分离纯化

1）树脂预处理 分别选用732阳离子树脂和717阴离子树脂，以及大孔吸附型树脂AB-8和D101进行海藻甜菜碱的分离纯化.按常规方法将阴阳离子交换树脂先后用酸碱处理后，以蒸馏水洗至中性，待用.酸碱的用量均为加入树脂体积的2倍.大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24 h后，用乙醇洗至加入3倍量的蒸馏水无混浊，再用蒸馏水洗至无醇味即可，待用.

2）静态吸附、解吸附实验 称取上述4种预处理好的树脂各2.50 g，分别置入100 mL具塞三角瓶中，精确量取10.02 mg/mL甜菜碱标准溶液b各10.00 mL，在30℃摇床振荡吸附3 h，待吸附达平衡后，测定各溶液中甜菜碱的浓度C（emg/mL）.滤除甜菜碱吸附残液，以适量蒸馏水清洗树脂后，向各树脂中加入5%氨水溶液各10.00 mL，振荡解吸附3 h，待解吸附平衡后，测定氨水解吸液中甜菜碱的含量C（dmg/mL）.树脂的单位吸附量Q（mg）、吸附率E（%）及解吸附率D（%）计算如下：

式中，C0为甜菜碱的初始浓度（mg/mL）；Ce为甜菜碱的平衡浓度（mg/mL）；Vi为加入的甜菜碱溶液的体积（mL）；W为树脂的质量（g）；Cd为解吸液中甜菜碱浓度（mg/mL）.

在筛选出适宜的732阳离子交换树脂后，继续考察吸附液的pH值（3.0，5.0，7.0，9.0，11.0），以及解吸液氨水的浓度（1%、3%、5%、7%、9%）对吸附和解吸附的影响.

3）动态吸附、解吸附曲线 称取已预处理好的732树脂2.00 g于玻璃层析柱（Ø10×300 mm）中，加入10.02 mg/mL甜菜碱标准溶液b 20.00 mL，以2 BV/h（BV为树脂床体积）的流速进行动态吸附，收集流出液.测定不同流出液中甜菜碱的浓度，绘制动态吸附曲线.待吸附饱和后，将5%的氨水溶液按2 BV/h流速通过已吸附饱和的732树脂，测定不同解吸液中甜菜碱的浓度，绘制动态解吸附曲线.

4）阴阳离子柱串联吸附 鉴于甜菜碱在酸性条件下为阳离子型化合物，可考虑用717树脂吸附甜菜碱提取液中的阴离子杂质，以进一步纯化提取物中甜菜碱的含量.海藻样品经水提取浓缩后，加入适量乙醇调至80%乙醇溶液，静置10 h，将醇沉滤液的pH值调至3.0，分3组进行实验：第1组仅过732阳离子树脂作为参照组；第2组先过732阳离子树脂再过717阴离子树脂；第3组先过717阴离子树脂再过732阳离子树脂，以考察不同串联吸附方式对纯化甜菜碱的影响.上述3组树脂柱吸附饱和后，均以5%氨水洗脱得洗脱液，收集流出的洗脱液，每5 mL接一份，根据动态解吸附曲线检测结果合并不同洗脱液中甜菜碱含量高的部分（即前20 mL），经旋转蒸发仪减压浓缩至近干，浓缩液转移至表面皿干燥至恒重，称重并按2.1方法检测其甜菜碱含量，比较不同串联方式的影响.

3 结果与讨论

3.1 甜菜碱标准曲线

按2.2方法配制的甜菜碱标准溶液a浓度为1.050 mg/mL，准确量取该溶液1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL，依次分别加入蒸馏水2.50 mL、2.00 mL、1.50 mL、1.00 mL、0.50 mL、0 mL，得到甜菜碱系列标准溶液（浓度范围0.300～1.050 mg/mL），再加入雷氏盐经冷冻沉淀、离心、萃取后在525 nm下测量吸光度.以吸光度为纵坐标（Y）、甜菜碱浓度为横坐标（X,mg/mL） 进行线性回归，得其线性方程：Y=0.2542X-0.0038，线性相关系数R为0.997.

3.2 甜菜碱分离纯化结果

3.2.1 树脂静态吸附和解吸附筛选结果

按2.3方法测定4种树脂对甜菜碱粗提取液的静态吸附、解吸附效果，结果列于表1.可看出：732阳离子交换树脂的吸附和解吸附效果均较好，树脂单位吸附量为36.79 mg，吸附率为91.47%，解吸附率为75.20%；717阴离子树脂的吸附和解吸附效果次之；其他两种大孔吸附树脂对甜菜碱的吸附率均小于50%，解吸附率小于38%.故以吸附和解吸附性能较好的732阳离子交换树脂进行后续实验.这主要与甜菜碱结构中的氮原子更易带正电荷有关，该结论可由甜菜碱质谱正离子扫描模式得到验证[11-12].

表1 4种树脂的静态吸附和解吸附结果

3.2.2 吸附液pH值对732树脂吸附性能的影响

不同pH值的吸附液对732阳离子交换树脂吸附甜菜碱的影响如图1所示.由图1可见：1）在中性和酸性条件下，732阳离子交换树脂对甜菜碱的吸附率在90%以上，单位吸附量也相应较高；2）吸附液酸性越高，732阳离子交换树脂的吸附效果越好，故后续实验选择吸附液pH=3.0，此时吸附率可达95%；3）732阳离子交换树脂的吸附效果随pH值的升高而降低，这可能缘于甜菜碱在酸性条件下分子呈开环状态，其阳离子状态利于交换吸附，而在碱性条件下，甜菜碱本身的电离受抑制，分子呈环状结构，导致甜菜碱与732树脂间的离子交换受影响，吸附率降低.

3.2.3 解吸液氨水浓度对732树脂甜菜碱解吸附率的影响

以氨水作解吸剂，不同的氨水浓度对甜菜碱的解吸附结果见图2：1）低浓度的氨水即可得到较好的洗脱效果，说明碱性条件下甜菜碱容易成环利于洗脱；2）随氨水浓度的增大解吸附率也增大，当氨水浓度超过5%时，解吸附率的增长幅度开始减小.由于碱性较强不利于后续处理，故动态解吸实验采用5%的氨水溶液.

图1 吸附液pH值对732树脂吸附甜菜碱性能的影响

3.2.4 动态吸附和解吸附曲线

甜菜碱标准溶液b（10.02 mg/mL）流出液体积与吸附残液中甜菜碱浓度关系如图3-a所示：该浓度吸附液处理15 mL甜菜碱溶液时，基本不发生泄漏；继续上柱吸附液到20 mL后，甜菜碱开始泄露，且穿透变化迅速；吸附液达30 mL后完全穿透，不再吸附；继续上柱吸附液会导致原吸附在732树脂上的甜菜碱有少量洗脱损失.以5%的氨水溶液洗脱上述吸附饱和的732树脂，流出液体积与洗脱液中甜菜碱的浓度关系如图3-b所示：洗脱液到20 mL时甜菜碱已基本洗脱完全，解吸率达99%，即具有较好的解吸附效果.

图2 氨水浓度对732树脂甜菜碱解吸附率的影响

图3 甜菜碱动态吸附和解吸附曲线

3.3 阴阳离子树脂串联方式对吸附解吸附效果的影响

分别采用单一阳离子树脂和阴阳离子树脂串联的方式来研究实验海藻样品的吸附和解吸附性能，比较其对甜菜碱的分离效果.经树脂分离纯化后的海藻提取物样品的质量与甜菜碱的含量列于表2.实验发现：1）仅过阳离子柱的最终产物是淡黄色的固体，而过阴阳两种离子交换树脂的流出液，无论两种树脂的吸附顺序如何，经浓缩后均得到白色固体，说明提取物中的有色杂质可能为阴离子，且可被717树脂吸附去除；2）不同串联方式下，最终纯化提取物中甜菜碱的含量差别较大，其中717+732效果最好，其浸膏中的甜菜碱含量可达7.95%，这可能是由于吸附液中的杂质首先被阴离子树脂吸附后，样品基质变得更为简单，干扰离子占据树脂吸附位点的几率大幅下降，具体机理有待于进一步研究.

表2 树脂串联方式对甜菜碱吸附和解吸附效果的影响

4 结论

本文考察了4种树脂对甜菜碱的吸附、解吸附效果，结果发现离子交换树脂比大孔吸附树脂更适于甜菜碱的分离纯化；732阳离子树脂对甜菜碱的吸附能力较佳，其在pH=3.0的酸性条件下吸附率较高，单位吸附量为38 mg，5%的氨水对该树脂的解吸附效果较好；阴、阳两种离子交换树脂柱串联纯化的效果明显优于仅过阳离子树脂，且先过阴离子树脂除杂再用阳离子树脂的吸附、解吸附的串联吸附法效果最佳.本文方法有望用于批量甜菜碱类似物的分离与纯化，也适用于天然产物中在特定条件下呈离子型的化合物.