蛹虫草主要成分虫草素、腺苷提取方法对比

马麦艳　张相锋　焦子伟

摘要利用前期加速溶剂萃取法提取腺苷、虫草素的优化结果，分别挑选最优处理进行试验，即提取腺苷最适条件为温度70C、时间10min、乙醇含量20%、循环2次，提取虫草素最适条件为温度1009C、时间15min、乙醇含量0%.循环2次。并将该方法与水热回流法、醇热回流法、超声水提法、超声醇提法4种传统方法进行比较，结果表明，加速溶剂萃取法明显优于其他传统4种方法，各个方法之间差异达显著水平（P<0.05）;加速溶剂荜取法提取腺苷效果最好，提取量为2118.07μg/g，提取效果最差的是超声波醇提法，提取量仅有180.72μg/g;加速溶剂萃取法提取的虫草素量为19678.70μg/g，超声波醇提法提取虫草素效果最差，提取量仅有4108.27μg/g;加速溶剂萃取法有其明显的优势，操作简单、方便快捷。

关键词 蛹虫草;加速溶剂萃取法;虫草素;腺苷;成分提取

中图分类号 TS264.3

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）05-0220-03

虫草素（Cordycepin），全称3一脱氧腺苷，分子式为C.gH3N，O3，是核苷类的一种，pH值偏碱性，常温下是固态晶体，性状为片状或针状，其熔点为230～231C"，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿等有机溶剂，紫外光最大吸收波长为259nm！2。腺苷也是核苷类的一种，具有抑制中枢神经递质的释放、改善心脑血液循环等作用34。一般提取虫草素的方法都能一并获得腺苷，已报道的传统提取方法有浸提法、超声法、索氏提取法、回流法、渗漉提取法等15日。钟艳梅等叫以人工蛹虫草固定培养残基为原料，采用索式提取法提取虫草素，结果表明，水比乙醇更利于提取虫草素。王英娟等8也采用超声法、回流法与提取溶剂水.乙醇组合的4种提取方法获得虫草素，结果表明，水热回流法效果最佳。谭琪明等后续采用传统的高温水浴提取技术获得蛹虫草小麦培养基中的虫草素，提取率为94.87%，进一步说明了水提取虫草素的优势，超声波提取法也是一种传统方法，张嘉等叫通过比较不同方法得出超声波提取法的提取效果最好。快速溶剂萃取仪（Accelerated Solvent Extraction，ASE）1-19，是利用溶剂对固体、半固体的样品进行萃取16，近几年，在国内外均有利用ASE提取天然活性成分的研究，但利用加速溶剂萃取法提取蛹虫草中虫草素及腺苷尚未见报道。目前，虫草素分离纯化是研究的一个热点领域，本文利用前期对加速溶剂萃取法提取虫草素、腺苷优化结果，在此基础上，分别挑选提取腺苷和虫草素最好的处理，与水热回流法醇热回流法、超声水提法、超声醇提法4种传统方法进行比较，确定最佳的提取工艺方法。通过用HPLC测定虫草素含量来比较各个方法的优劣，以期为伊犁乃至新疆地区蛹虫草主要活性物质的提取提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株。蛹虫草为本实验室人工培育，虫草素及腺苷标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.1.2供试试剂。乙醇（C2HsoH），分析纯，购自德州润昕实验仪器有限公司;乙腈（C2H3N），色谱纯，购自德州润昕实验仪器有限公司;超纯水。

1.2试验方法

1.2.1虫草素腺苷标准品的配制。参考陈方圆等叫的方法，腺苷、虫草素标准品各取10mg（按实际含量折算），用流动相（乙腈：水为5：95）定容至100mL，摇匀。

1.2.2标准曲线绘制。参考陈方圆等四的方法进行标准曲线绘制。

1.3试验设计

1.3.1蛹虫草粉前处理。将若千晒干的蛹虫草子实体放入粉碎机中粉碎约1min，粉碎的蛹虫草子实体粉末过60目筛子，将样品混匀后用电子分析天平称取3份（每份5g）用于后续加速溶剂萃取法萃取腺苷、虫草素;分别称取12份（每份4g）用于后续水热回流法、醇热回流法、超声波水提法超声波醇提法提取腺苷和虫草素。

1.3.2加速溶剂萃取法。前期对加速溶剂萃取法提取虫草素腺苷条件进行了优化，本试验在此基础上分别挑选最好的处理与4种传统方法进行比较，即提取虫草素最适处理为温度100C时间15min、乙醇含量0%、循环2次，提取腺苷最适条件为温度70C时间10min，乙醇含量20%、循环2次。

1.3.3传统方法。一是水热回流法。将称取的蛹虫草粉用双蒸水定容至100mL，于100C热回流2h放冷后4000r/min离心10min，过0.22μm滤膜收集滤液。二是醇热回流法。将称取的蛹虫草粉用50%乙醇定容至100mL，于80C热回流2h放冷后4000r/min离心10min，过0.22μm滤膜收集滤液24-251。三是超声波水提法。将称取的蛹虫草粉用80mL蒸馏水溶解，然后于25C、100Hz超声波清洗器中超声3h，定容至100mL，4000r/min离心10min，过0.22μm滤膜收集滤液。四是超声波醇提法。将称取的蛹虫草粉用乙醇与水的混合液（1：1）80mL溶解，然后于25C、100Hz超声波清洗器中超声3h，定容至100mL，4000r/min离心10min，过0.22μm滤膜收集滤液。

1.4高效液相色谱（HPLC）

检测条件：色谱柱C18（4.6mmx250mm，5μm）;流动相乙腈：水=5：95;流速为1.0mL/min;柱温为35C;进样量为10μL，在波长260nm紫外检测器检测。将不同梯度的虫草素和腺苷标准品溶液，通过标样峰面积制成标准曲线。将被测提取液分别进行高效液相色谱检测，依据标准曲线计算各处理样品虫草素和腺苷含量。相关公式参考陈方圆等的方法。

1.5数据统计分析

本研究数据以平均值为计算值，數据分析采用SPSS软件（Version11.5，USA）、EXCEL软件进行数据处理与方差分析（ANOVA）。

2结果与分析

2.1标准曲线计算

称取腺苷、虫草素标准品，分别配成浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的溶液，各取10μL进样分析。依据标准曲线确定线性范围，得出虫草素线性回归方程为Y=32.241X-1.2731，相关系数R=0.9999;腺苷线性回归方程为Y=33.443X-9.0664，相关系数R=0.9993。

2.2HPLC色谱图

标准品与样品测定结果如图1所示。图中峰A为腺苷色谱峰，峰B为虫草素色谱峰。图1（a）为50μg/mL虫草素、腺苷标准品混合液的色谱图，从中可以看出，色谱图中虫草素腺苷实现了基线分离，而且出峰时间也控制得比较好，出峰时间为A=7.281min、B=9.943min，该流动相条件可以用来定量检测虫草素、腺苷的含量。图1（b）～（f）为5组不同方法的色谱图，不同处理虫草素、腺苷出峰时间与标准品相似，加速溶剂萃取法出峰時间A=7.204min、B=10.098min，水热回流法出峰时间A=7.284min、B=10.008min，醇热回流法出峰时间A=7.288min、B=10.077min，超声波水出峰时间A=7.287min、B=9.958min，超声波醇提法出峰时间A=7.271min、B=10.158min，说明该仪器运行稳定，数据准确。

2.3腺苷含量

由表1可知，用5种不同方法提取腺苷，结果发现各种方法之间提取的腺苷含量差异达显著水平（P<0.05，下同）。其中，加速溶剂萃取法提取效果最好，提取腺苷量为2118.07μg/g;超声波水提法次之，提取量为1702.40μg/g;腺苷提取效果最差的是超声波醇提法，提取量仅有180.72μgg。

2.4虫草素含量

用5种不同方法提取虫草素，发现不同方法之间差异均达到显著水平，，其中，提取虫草素效果最好的是加速溶剂萃取法，该方法提取虫草素的量为19678.70μg/g;超声波水提法次之，虫草素提取量为10217.45μg/g;其次是水热回流法，虫草素提取量为6018.21μg/g;醇热回流法次之，提取量为5293.10μg/g;超声醇提法提取虫草素效果最差，提取量仅有4108.27μg/g。

3结论与讨论

超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法是提取腺苷、虫草素的常用方法，已有不少学者做过相关试验，由于原料不同、条件差异等方面的因素，导致得到的结果也有差异。吴勇等问采用上述方法和渗漉法、微波法共6种方法来提取虫草素，通过试验以提取量的多少将这几种方法进行排序：渗漉法>微波法>水热回流法>醇热回流法>超声波水法>超声波醇法。随后韩建华等29也做了相关试验，采用超声波水提法、超声波醇提法水热回流法和醇热回流法提取腺苷和虫草素，结果表明，超声波水提法是最优方法，本组试验目的和韩建华等的相同，即比较5种不同提取方法提取腺苷、虫草素的效果。

加速溶剂速萃取法是近些年新出现的一种新型提取方法，其原理和CO2超临界萃取仪相似，该方法具有操作流程简单、全自动、溶剂用量少、时间短、材料前后期处理简便等优点叫。目前，不少学者利用加速溶剂萃取法得到了生物碱、苷类等物质。赵恒强等171用此法从黄连中提取黄连素（盐酸小檗碱）并用正交试验对试验条件优化，确定该方法适合提取黄连内的生物碱，最佳提取条件是温度130C、80%C2H，0H+0.5%HCI作提取溶剂、静态提取10min.提取1次;石矛等18得到人参总皂苷，确定最佳工艺参数为提取温度140C、提取时间5min、循环次数3次。但目前用此方法提取腺苷、虫草素的研究很少。前期笔者对加速溶剂萃取法提取腺苷、虫草素条件进行了优化，本试验在此基础上分别挑选提取腺苷、虫草素效果最好的处理与其他4种传统方法进行了比较。结果发现，该技术与传统提取腺苷、虫草素方法相比具有明显优势，它是利用高压、高温条件，快速从蛹虫草中提取出腺苷、虫草素，并且提高了虫草素在溶剂中的溶解度和溶出速率。加速溶剂萃取腺苷、虫草素的研究，为提取腺苷、虫草素增加了选择方法。

试验结果表明，加速溶剂萃取法明显要优于其他传统4种方法，该方法提取的虫草素量为19678.70μg/g，超声波醇提法提取虫草素效果最差，提取量仅有4108.27μg/g。加速溶剂萃取法具有明显的优势，操作者只需将所有样品放人仪器一般等待5～20min即可完成萃取。在后期检测时也只需定容、过膜就可直接上HPLC检测虫草素、腺苷的含量综上所述，加速溶剂萃取法用于提取蛹虫草中虫草素及腺苷更为方便快捷。本试验为伊犁乃至新疆地区蛹虫草主要活注物质提取提供了一定的技术参考依据。

4参考文献

[1]徐廷万，王丽波段文健，等人工蛹虫草胞外多糖对受抑制的免疫功

能的影响及抗疲劳作用[J].中药药理与临床，2002，18（6）：17-18.

[2]陈毓荃生物化学实验方法和技术[M].北京：科学出版社，2003：102-106.

[3] PELLEG A， PORTER R S.The pharmacology of adenosine[J].Pharmacot- herapy ：The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy， 1990， 10（3）：157-174.

[4] KITAKAZE M， HORI M.Adenosine therapy ：a new approach to chronic heart failure[J].Expert Opinon on Investigational Drugs ， 2009 ，9（11）：2519- -2535.

[5]黄子琪，贲松彬，桑育黎，等微波法与超声破碎法提取蛹虫草菌丝体中虫草素的比较研究[J].食品科学，2009，30（18）：176-180.

[6]吴勇，陈卫东，王利，等.蛹虫草培养基中虫草素的几种提取方法比较|[J].安徽药业，2010，14（3）：284-285.

[7]钟艳梅，黄志全，温凯.人工蛹虫草固体培养残基中虫草素的提取分离研究[J]现代食品科技，2007，23（2）：40-42.

[8]王英娟，李多伟，王义潮，等.蛹虫草中虫草素虫草多糖综合提取工艺研究[J].西北植物学报，2005，25（9）：1863-1867.

[9]谭琪明，何珺，文庭池，等蛹虫草小麦培养基中虫草素提取工艺的研究小山地农业生物学报，2011，30（4）：357-361.

[10]张嘉，李多伟，任静.正交试验提取虫草素的工艺研究[J].中国新医药，2004，3（2）：34-35.

[11] RICHTER B E，JONES B A， PORTER L N， et al.Accelerated solvent extraction： A technique for sample preparation[J].Analytical and Bioan-alytical Chemistry， 1996 ， 68（6）： 1033.

[12]王淑红，熊英，王祥红.加速溶剂萃取法用于灯盏细辛中灯盏乙素的测定[J].药物分析杂志，2006，26（5）：703.

[13]陈舰，张景华.快速溶剂萃取一高效液相法测定茶叶中多菌灵残留量小.广东化工，2011，38（1）：170.

[14]刘斌.加压溶剂提取一HPLC法同时测定老鹰茶中7个黄酮类化合物[J].药物分析杂志，2010，30（8）：1424.

[15] WONG LJ ，CURTIS L W.R.ecent advances in extraction of neutraceuti-cals from plants[J].Trends in Food Science & Technology ，2006， 17（6）：300.

[16]刘志，阮长春，刘天志，等.HPLC法同时测定林下参、鲜人参.生晒

参和红参中14种人参皂苷[J].中草药，2012，43（12）：2431-2434.

[17]喻凌寒，宋之光，陈江韩，等.快速溶剂萃取反向高效液相色谱法测定青蒿中的青蒿素[J].分析实验室，2006（8）：68-71.

[18]刘平怀，刘洋洋，时杰，等加速溶剂萃取（ASE）技术提取海南萝芙木活性成分[J].精细化工，2009，26（11）：1120-1123.

[19] PAPAEFSTATHIOU G， POLYCHRONOPOULOS P，ALIGIANNIS N，et al.Comparaive study of accelerated solvent extraction and supercriticalfluid extraction of total phenolics and flavonoids from Sideritis faeserisubsp attica and atudy pf antioxidant activity[J].Panta Medica， 2008 ，74（9）：1122.

[20]宋文斌，代英成，許敏，等.加速溶剂萃取一液相色谱紫外检测法测

定人参中多种人参皂甙含量[]现代科学仪器，2009（6）：104-108.

[21] ARAPITSAS P， SJOBERG P J R ，TURNER C.Characterisation of anth - -ocyanins in red cabbage using high resolution liquid chromatographycoupled with photodeode array detection and electrospray ionization-liner ion trap mass spectrometry[J].Food Chemistry，2008， 109：219-226.

[22] MURAT GIZIR A，NUZHET TURKER ， ERDEM ARTUVAN.Pressur- ized acidifide water extraction of black carrot （ Daucus carota ssp.saticuscar.atrorubens Alef. ）anthocyanins[J].European Food Research and Te-chnology ， 2008 ， 226：363-370.

[23]陈方圆，马麦燕，张相锋，等加速溶剂萃取法提取蛹虫草主要成分工艺优化分析[J].新疆农业科学，2018，55（5）：928-935.

[24]韩建华，杨淑芳，孙继红，等.蛹虫草中虫草素、腺苷综合提取工艺研究[J].北方蚕业，2011，32（4）：24-27.

[25]申进文，孙晓萍，赵旭，等.人工蛹虫草核苷类成分超声提取工艺优

化及HPLC定量分析[J].河南农业大学学报，2011，45（4）：391-394.

[26] CONNOLLY G P，DULEY J A.Uridine and its nucleotides ： biological actions ， therapeutic potentials[J].Trends in Pharmacological Sciences，1999，20（5）：218-225.

[27]赵恒强，陈军辉，郭秀春，等加速溶剂萃取法快速提取黄连中的生物碱[J].分析试验室，2008，27（11）：5-9.

[28]石矛，陈丽娜.快速溶剂萃取仪提取保健食品中人参皂苷条件优化[J]：食品安全质量检测学报，2016，7（1）：39-43.