不同配方下固体培养蛹虫草活性成分含量比较
2015-01-15翁梁温鲁
翁梁+温鲁
摘要：以蚕蛹、黄豆、玉米糁、蛋白胨为原料固体栽培蛹虫草，研究不同配方培养基对蛹虫草虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量的影响。结果表明，配方5下蛹虫草虫草素含量最高，配方1下腺苷含量最高，配方4下多糖、虫草酸含量最高，在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁、蛋白胨有利于蛹虫草活性物质的提高。
关键词：蛹虫草；配方培养基；虫草素；腺苷；多糖；虫草酸
中图分类号：S567.3+50.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0351-02
蛹虫草别称北冬虫夏草、北虫草等，是冬虫夏草的近缘种，也是虫草属真菌的模式种[1]，其活性成分和医疗保健功效与冬虫夏草相近。冬虫夏草由于生境特殊、寄主单一、产量较低，加之人工培育技术难以突破，市场价格高昂。蛹虫草可以进行人工培育，其主要活性成分有虫草素、腺苷、多糖、虫草酸，特别是虫草素含量远高于冬虫夏草[2]，在药理或临床试验中可作为冬虫夏草的替代品。蛹虫草人工培养方式有固体培养、液体发酵、有蚕培养、蛹培养，还有用大米、小麦代料栽培或添加微量元素等，并在一些地区形成规模，但培育的蛹虫草活性成分含量不高。目前，以提高蛹虫草活性物质含量为指标，对蛹虫草发酵条件的优化研究从未间断，也取得了很大进展[3-5]。本研究采用固体培养，以蚕蛹作为基础培养基，适量添加黄豆、玉米糁、蛋白胨，比较不同配方对蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量的影响，以期为蛹虫草活性物质含量研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
菌种：蛹虫草H-3麦粒菌种，江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院食用菌课题组自行培育。
材料：蚕蛹（江苏省淮安市丝织厂），蛋白胨（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司），黄豆、玉米糁购自江苏省淮安市农贸市场。
药品与试剂：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙、葡萄糖、D-甘露醇、高碘酸钠、乙酸铵、冰醋酸、无水乙醇、苯酚、98%浓硫酸、磷酸氢二钾、四氢呋喃等均为分析纯，培养用水为自来水，分析用水为双蒸水。虫草素对照品、腺苷对照品由上海化学试剂公司进口分装。
1.2仪器设备
培养设备：高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱；样品处理设备：电热恒温鼓风干燥箱，粉碎机，台式离心机，电子天平，微波炉等；检测设备：美国Waters高效液相色谱仪系统（600Epump，600controller，2487紫外检测器，In-lineDegasserAF在线脱气机，Empower色谱数据管理系统）。
1.3方法
1.3.1培养基配制配方1：蚕蛹200g（蚕蛹干质量100g，按50%折算，下同），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，5mL水。配方2：蚕蛹140g，黄豆30g（蚕蛹与黄豆质量比为7∶3），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，45mL水。配方3：蚕蛹120g、黄豆40g（蚕蛹与黄豆质量比为6∶4），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，60mL水。配方4：蚕蛹100g、黄豆50g（蚕蛹与黄豆质量比为5∶5），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，75mL水。配方5：蚕蛹140g、玉米糁30g（蚕蛹与玉米糁质量比为7∶3），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，30mL水。配方6：蚕蛹120g、玉米糁40g（蚕蛹与玉米糁质量比为6∶4），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，40mL水。配方7：蚕蛹190g、蛋白胨5g（蚕蛹与蛋白胨质量比为95∶5），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，10mL水。配方8：蚕蛹180g、蛋白胨10g（蚕蛹与蛋白胨质量比为9∶1），加1.5%硫酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，2%红糖，20mL水。
1.3.2接种培养将配制好的培养基于115℃灭菌90min，冷却。在超净工作台上按无菌操作要求接入蛹虫草H-3菌种，每瓶接6粒麦粒菌种，置培养箱中于25℃下培养，培养结束后将培养物于60℃烘干，粉碎待测。
1.3.3样品处理采用微波法提取样品[6]。称取一定量样品粉末，用水作提取介质，料液比1∶100，经微波法辅助提取，并将提取液离心得上清液，备用。
1.3.4虫草素与腺苷测定采用HPLC法测定蛹虫草虫草素与腺苷[6]，上清液经0.2μm微孔滤膜压滤，色谱条件为：WatersNova-pakC18（3.9mm×300.0mm，4μm）；流动相为KH2PO4-K2HPO4+1%（体积分数）四氢呋喃缓冲液，pH值为6.86，流速为1.0mL/min，检测波长260nm。虫草素标准曲线回归方程为y=3.10×106x-1.34×104，r=0.9999；腺苷标准曲线回归方程为y=3.55×106x-5.72×103，r=0.9999；式中y为色谱峰面积，x为虫草素或腺苷的进样量。
1.3.5蛹虫草多糖测定蛹虫草多糖测定采用苯酚-硫酸法[7-8]。多糖在酸性条件下水解成葡萄糖等单糖，用葡萄糖配制系列标准溶液，于490nm处测定吸光度，得到葡萄糖含量（C葡萄糖）与吸光度（D）的回归方程：D=7.3542C葡萄糖+0.0532，r=0.9996。
1.3.6虫草酸测定采用高碘酸钠比色法测定虫草酸[9]。虫草酸的化学成分为D-甘露醇，用甘露醇配制系列标准溶液，于420nm处测定吸光度，得到甘露糖含量（C甘露糖）与吸光度（D）的回归方程：C甘露糖=104.5500D+0.3012，r=0.9999。
2结果与分析
2.1不同配方培养基对蛹虫草虫草素含量的影响endprint
蚕蛹营养丰富，蛋白质含量高，而且蛋白质中氨基酸种类齐全，可直接作为蛹虫草生长的培养基。由表1可知，试验所用8种培养基均适合蛹虫草生长，虫草素含量也较高，其中配方5下蛹虫草虫草素含量最高，达4.75mg/g。配方5和配方6虫草素含量差异显著，配方5、6与配方1、2、3、4、7、8虫草素含量差异极显著。从表1还可见，配方5、6、7、8虫草素含量大于配方1，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁、蛋白胨有利于虫草素积累；配方2、3、4虫草素含量小于配方1，说明在纯蛹培养基中添加黄豆未能提高蛹虫草虫草素含量。
2.2不同配方培养基对蛹虫草腺苷含量的影响
由表2可知，配方1下蛹虫草腺苷含量最高，达0.55mg/g，其次为配方5，配方8下蛹虫草腺苷含量最低。配方1、5与配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差异极显著。试验表明，在纯蛹培养基中添加黄豆、玉米糁、蛋白胨均未能显著提高蛹虫草腺苷含量。
2.3不同配方培养基对蛹虫草多糖含量的影响
表3显示，配方4下蛹虫草多糖含量最高，达75.67mg/g，配方8下蛹虫草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差异极显著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差异极显著，说明在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累。
2.4不同配方培养基对蛹虫草虫草酸含量的影响
由表4可知，配方4下蛹虫草虫草酸含量最高，达76.73mg/g，配方3下蛹虫草虫草酸含量最低。配方4和其他配方下的虫草酸含量差异极显著。
3结论与讨论
本研究对不同配方培养基处理下的蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量进行了比较。结果表明，配方5（蚕蛹与玉米糁质量比为7∶3）下蛹虫草虫草素含量最高，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁可显著提高虫草素含量；在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累；配方4（蚕蛹与黄豆质量比为5∶5）下蛹虫草虫草酸含量最高。综上，以纯蛹为基础培养基，添加适量黄豆、玉米糁、蛋白胨有利于蛹虫草虫草素、多糖、虫草酸含量的提高。但在该试验条件下，腺苷含量没有显著提高。如要提高腺苷含量，还须进一步研究。
蚕蛹营养价值高，可直接作为蛹虫草的培养基，添加适量黄豆、玉米糁后培养基碳氮比更加合理，有利于蛹虫草活性物质产生和积累。如果再配合其他育种技术，会使活性成分总量得到进一步提高。在纯蛹培养基中添加其他成分能否进一步提高蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量，还须深入研究。
参考文献：
[1]敬一兵，陆鲁生.虫草[M].昆明：云南科技出版社，1986：24.
[2]韦会平，肖波，胡开治.蛹虫草药用价值考[J].中药材，2004，27（3）：215-217.
[3]林群英，宋斌，李泰辉.蛹虫草研究进展[J].微生物学通报，2006，33（4）：154-157.
[4]翁梁，温鲁.硒和钙对蛹虫草活性物质含量的影响[J].北方园艺，2012（22）：159-161.
[5]王志高，温鲁，袁小转，等.加硒对蛹虫草主要活性成分含量的影响[J].安徽农业科学，2007，35（29）：9293-9294.[HJ1.9mm]
[6]翁梁，温鲁.TLCS与HPLC对比测定虫草中虫草素和腺苷含量[J].江苏农业学报，2008，24（4）：539-540.
[7]翁梁，温鲁，杨芳，等.不同提取方法对蛹虫草多糖抗氧化性的影响[J].食品科技，2008，33（11）：180-182.
[8]汪琼，徐增莱，吕晔.微波消解ICP-MS法测定冬虫夏草中30种无机元素含量[J].江苏农业科学，2013，41（2）：269-270.
[9]温鲁，翁梁，朱明伟，等.不同林区蛹虫草活性成分含量的比较[J].林业科学，2008，44（8）：149-151.endprint
蚕蛹营养丰富，蛋白质含量高，而且蛋白质中氨基酸种类齐全，可直接作为蛹虫草生长的培养基。由表1可知，试验所用8种培养基均适合蛹虫草生长，虫草素含量也较高，其中配方5下蛹虫草虫草素含量最高，达4.75mg/g。配方5和配方6虫草素含量差异显著，配方5、6与配方1、2、3、4、7、8虫草素含量差异极显著。从表1还可见，配方5、6、7、8虫草素含量大于配方1，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁、蛋白胨有利于虫草素积累；配方2、3、4虫草素含量小于配方1，说明在纯蛹培养基中添加黄豆未能提高蛹虫草虫草素含量。
2.2不同配方培养基对蛹虫草腺苷含量的影响
由表2可知，配方1下蛹虫草腺苷含量最高，达0.55mg/g，其次为配方5，配方8下蛹虫草腺苷含量最低。配方1、5与配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差异极显著。试验表明，在纯蛹培养基中添加黄豆、玉米糁、蛋白胨均未能显著提高蛹虫草腺苷含量。
2.3不同配方培养基对蛹虫草多糖含量的影响
表3显示，配方4下蛹虫草多糖含量最高，达75.67mg/g，配方8下蛹虫草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差异极显著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差异极显著，说明在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累。
2.4不同配方培养基对蛹虫草虫草酸含量的影响
由表4可知，配方4下蛹虫草虫草酸含量最高，达76.73mg/g，配方3下蛹虫草虫草酸含量最低。配方4和其他配方下的虫草酸含量差异极显著。
3结论与讨论
本研究对不同配方培养基处理下的蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量进行了比较。结果表明，配方5（蚕蛹与玉米糁质量比为7∶3）下蛹虫草虫草素含量最高，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁可显著提高虫草素含量；在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累；配方4（蚕蛹与黄豆质量比为5∶5）下蛹虫草虫草酸含量最高。综上，以纯蛹为基础培养基，添加适量黄豆、玉米糁、蛋白胨有利于蛹虫草虫草素、多糖、虫草酸含量的提高。但在该试验条件下，腺苷含量没有显著提高。如要提高腺苷含量，还须进一步研究。
蚕蛹营养价值高，可直接作为蛹虫草的培养基，添加适量黄豆、玉米糁后培养基碳氮比更加合理，有利于蛹虫草活性物质产生和积累。如果再配合其他育种技术，会使活性成分总量得到进一步提高。在纯蛹培养基中添加其他成分能否进一步提高蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量，还须深入研究。
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[9]温鲁，翁梁，朱明伟，等.不同林区蛹虫草活性成分含量的比较[J].林业科学，2008，44（8）：149-151.endprint
蚕蛹营养丰富，蛋白质含量高，而且蛋白质中氨基酸种类齐全，可直接作为蛹虫草生长的培养基。由表1可知，试验所用8种培养基均适合蛹虫草生长，虫草素含量也较高，其中配方5下蛹虫草虫草素含量最高，达4.75mg/g。配方5和配方6虫草素含量差异显著，配方5、6与配方1、2、3、4、7、8虫草素含量差异极显著。从表1还可见，配方5、6、7、8虫草素含量大于配方1，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁、蛋白胨有利于虫草素积累；配方2、3、4虫草素含量小于配方1，说明在纯蛹培养基中添加黄豆未能提高蛹虫草虫草素含量。
2.2不同配方培养基对蛹虫草腺苷含量的影响
由表2可知，配方1下蛹虫草腺苷含量最高，达0.55mg/g，其次为配方5，配方8下蛹虫草腺苷含量最低。配方1、5与配方2、3、4、6、7、8腺苷含量差异极显著。试验表明，在纯蛹培养基中添加黄豆、玉米糁、蛋白胨均未能显著提高蛹虫草腺苷含量。
2.3不同配方培养基对蛹虫草多糖含量的影响
表3显示，配方4下蛹虫草多糖含量最高，达75.67mg/g，配方8下蛹虫草多糖含量最低。配方2、3、4和配方1、5、6、7、8多糖含量差异极显著，配方5、6和配方1、7、8多糖含量差异极显著，说明在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累。
2.4不同配方培养基对蛹虫草虫草酸含量的影响
由表4可知，配方4下蛹虫草虫草酸含量最高，达76.73mg/g，配方3下蛹虫草虫草酸含量最低。配方4和其他配方下的虫草酸含量差异极显著。
3结论与讨论
本研究对不同配方培养基处理下的蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量进行了比较。结果表明，配方5（蚕蛹与玉米糁质量比为7∶3）下蛹虫草虫草素含量最高，说明在纯蛹培养基中添加适量玉米糁可显著提高虫草素含量；在纯蛹培养基中添加适量黄豆、玉米糁有利于蛹虫草多糖的产生和积累；配方4（蚕蛹与黄豆质量比为5∶5）下蛹虫草虫草酸含量最高。综上，以纯蛹为基础培养基，添加适量黄豆、玉米糁、蛋白胨有利于蛹虫草虫草素、多糖、虫草酸含量的提高。但在该试验条件下，腺苷含量没有显著提高。如要提高腺苷含量，还须进一步研究。
蚕蛹营养价值高，可直接作为蛹虫草的培养基，添加适量黄豆、玉米糁后培养基碳氮比更加合理，有利于蛹虫草活性物质产生和积累。如果再配合其他育种技术，会使活性成分总量得到进一步提高。在纯蛹培养基中添加其他成分能否进一步提高蛹虫草中虫草素、腺苷、多糖、虫草酸含量，还须深入研究。
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[9]温鲁，翁梁，朱明伟，等.不同林区蛹虫草活性成分含量的比较[J].林业科学，2008，44（8）：149-151.endprint
