奶牛乳房炎常见致病菌的分离及药敏试验

吴海燕 王纯结 敖日格乐 姜 艳 裴大伟

1.内蒙古自治区兴安盟科尔沁右翼前旗动物疫病预防控制中心，内蒙古兴安盟科右前旗137400；2.内蒙古农业大学，呼和浩特010018

奶牛乳房炎主要由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌等致病菌引起[1-2]。目前治疗奶牛乳腺炎首选抗生素，但随着耐药菌株的不断增多和耐药性的不断变化，抗生素的残留问题日益突出[3]，迫切需要一种安全、绿色的奶牛乳腺炎治疗方法。蒙药由纯天然的矿植物组成，含有多种生物有效成分。本研究通过对患有奶牛场乳房炎的牛奶样中分离出的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌进行体外抑菌试验，初步探讨奶牛乳房炎主要致病菌的耐药特征并比较2 种蒙药与抗生素抗菌差异，为该蒙药复方的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）奶样采集。奶样采自呼和浩特市周围奶牛场50头患有临床型乳房炎的奶牛。用温水清洗乳房，擦干后用2 g/L 的新洁尔灭和酒精棉对奶牛乳房进行消毒，弃去前2～3 把奶，每头采奶样约4 mL 于灭菌的离心管中，加盖封紧，标明牛号。

2）培养基及试剂。营养肉汤、营养琼脂平板、麦康凯培养基、伊红美兰培养基、高盐甘露醇培养基、5%绵羊鲜血琼脂平板、血清平板，均按说明书配制；药敏纸片和生化鉴定所用的微量发酵管，以上均购自广东环凯生物科技有限公司。

3）试验仪器。HPS-250 生化培养箱、FLC-3 超净工作台、BP211D 电子天平、全不锈钢立式高压灭菌锅。

1.2 试验方法

1）奶牛乳房炎病原菌分离、鉴定试验。将采集的乳样分别在普通琼脂平板、5%绵羊鲜血琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板上进行划线培养(37 ℃,24 h)，观察细菌菌落生长情况，并进行涂片、镜检和纯培养[4]。根据细菌生化鉴定试剂盒说明进行生化鉴定。

2）蒙药复方药敏试验。将金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌接种于普通肉汤培养基中，37 ℃培养18 h。用营养肉汤校正浓度至0.5 麦氏比浊标准，约含1×108～2×108CFU/mL。将其稀释100 倍至1×106～2×106CFU/mL。用“L”型涂菌棒均匀涂布于整个培养基表面。用置杯器放置牛津杯，分别将100 μL 药液加入制备好的带有菌层平皿中的牛津杯内，盖好，37 ℃培养24 h。游标卡尺测量抑菌圈直径。大于15 mm 为极度敏感；大于10 mm 且小于15 mm 为高度极敏；大于8 mm 且小于10 mm 为敏感；小于8 mm 为不敏感[5]。

3）抗生素药敏试验。纸片扩散法(K-B 法)，将分离菌纯化后进行药敏试验，37 ℃,24 h 培养后测量各种药物的抑菌环直径。试验结果判定：参照NCCLS (2007)公布的标准以敏感(susceptible)、中敏(intermediate)和耐药(resistant)3 种形式对抑菌圈大小进行分类。耐药率=耐药菌株数/试验菌株数×100%。

2 结果与分析

2.1 常见致病菌的分离鉴定

1）培养及染色特性。奶牛乳房炎病原菌培养显示，A 类菌呈单个，短粗，菌体较小，革兰氏染色反应为阴性，在伊红美蓝上形成黑色有金属光泽、光滑、湿润、隆起的中等大小菌落，在普通琼脂和血琼脂上为圆形乳白色菌落。B 类菌呈圆形或椭圆形，较大，单个或成对，个别有四联球菌，革兰氏染色反应为阳性，在普通琼脂和血琼脂上生长良好，形成金黄色或白色小菌落，金黄色菌落在血琼脂上呈明显的溶血，白色菌落在血琼脂上不溶血。C 类菌呈圆形，革兰氏染色反应为阳性，成短链状排列，在普通琼脂上为白色或灰白色细小菌落。在血琼脂上为灰白色半透明、隆起、粘稠的小菌落，有的有明显的β溶血。

2）动物试验。注射链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的小鼠初期出现肌肉震颤、精神沉郁等症状，以后精神逐渐恢复，48 h 内有3 只死亡，用培养基回收到攻毒菌。

3）生化鉴定。将分离到的36 个菌株进行纯培养并采用生化试验进行鉴定，结果见表1～表3，表1～表3中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表1 A 类菌株生化反应试验结果

表2 B 类菌株生化反应试验结果

表3 C 类菌株生化反应试验结果

表4 蒙药复方药敏试验结果（抑菌圈直径M±S）

根据培养、形态、染色以及生化试验结果及参考文献[6]，可初步判定所分离菌中A 类为大肠杆菌，B 类为金黄色葡萄球菌，C 类为链球菌（C1 无乳链球菌，C2 为停乳链球菌）。对所分离病原菌进行鉴定，结果为：从50 份样品中分离细菌，经培养特性、染色镜检、生化鉴定等试验，鉴定出无乳链球菌13 株，占分离菌的27%，大肠杆菌17 株，占分离菌的35%，金黄色葡萄球菌18 株，占分离菌的37%。其中，9 份乳样则未检出细菌，可能为非特异性乳房炎或者是由其他病原微生物引起。

2.2 蒙药复方药敏试验

对分离到的致病菌进行传统蒙药复方和正交蒙药复方药敏试验。由表4可知，正交蒙药复方和传统蒙药复方对金葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌的抑菌圈均大于15 mm，为极敏感，有效地抑制病原菌的生长。2 种蒙药复方之间无显著性差异（ ＞0.05）。

2.3 抗生素药敏试验

选择性对分离到的致病菌株进行了5 类共11种药物敏感试验。由表5可见，大肠杆菌对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、阿米卡星、链霉素等药物高度敏感；对克林霉素、红霉素、四环素等药物中度敏感；对青霉素、阿莫西林、头孢噻吩等药物不敏感，耐药率达到94%以上。金黄色葡萄球菌对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、阿米卡星等药物高度敏感；对链霉素、四环素、红霉素等药物中度敏感或不敏感；对青霉素、阿莫西林、克林霉素、头孢噻吩等药物耐药率分别为100%、88.9%、94.4%、94.4%。而链球菌对庆大霉素和阿米卡星高度敏感；对卡那霉素、四环素、红霉素、阿莫西林、环丙沙星、头孢噻吩等中度敏感；对青霉素及克林霉素、链霉素不敏感，耐药率达到84.6%以上。

3 讨 论

导致奶牛乳房炎的病原微生物种类繁多，有细菌、真菌、病毒、支原体等，但95%以上都是由细菌引起的[7-8]。本研究经细菌培养特性、形态染色特性、生化特性等鉴定表明，50 份奶样中共分离到48 个菌株，其中A 类17 个菌株为大肠杆菌，占分离菌的35%；B 类18 个菌株为金黄色葡萄球菌，占分离菌的37%；C 类13 个菌株则为链球菌，占分离菌的27%。本试验分离鉴定的细菌种类及所占的比例情况，与其他文献报道的其他地区奶牛乳房炎细菌鉴定结果略有不同[9-10]，其原因可能是由于各地气候、地理位置以及不同地区牛场的卫生管理措施存在差异有关。

当长期应用抗菌药物时，敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株不断大量繁殖，代替敏感菌株，促使细菌对抗菌药物的耐药率不断升高。本研究抗生素药敏验结果表明，链霉素、卡那霉素、庆大霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌有较强的抑菌效果，尤其是卡那霉素效果突出。β-内酰胺类中青霉素类药物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌抑菌效果不明显。头孢噻吩对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果较差，克林霉素对金黄色葡萄球菌和链球菌的抑菌活性较差，大环内酯类的红霉素对链球菌，金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，环丙沙星对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用。刘大成等[11]报道金黄色葡萄球菌对四环素、庆大霉素、卡那霉素等药物高度敏感；链球菌对红霉素、喹诺酮类以及庆大霉素等均高度敏感，大肠杆菌对四环素、庆大霉素、喹诺酮类等均高度敏感，而对青霉素均产生了不同程度的耐药性；与本试验结果基本相符。邓海平等[12]报道，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌对青霉素、红霉素具有较强的耐药性，对环丙沙星、庆大霉素较为敏感，本试验结果与其基本相符。

表5 抗生素药敏试验结果

蒙药复方药敏试验结果显示，2 种蒙药复方对所分离的病原菌有较好的抑制作用，为蒙药治疗奶牛乳房炎提供了有力的依据。随着抗生素耐药性的日趋增强，急需开发能够替代抗生素，且毒副作用小、无残留的产品。有研究表明，蒙药制剂不但能够直接抑杀病原微生物，而且能够提高机体的免疫机能。因此，蒙药在治疗乳房炎方面具有很大发展前景。