桑根酮C体内外抗肿瘤作用研究

王艺，李妍，谢天平，王喆，张梅

(石河子大学药学院药理系,新疆 石河子 832000)

癌症，是严重危害人类健康、导致现代人类死亡的第一大恶疾和顽症。世界卫生组织调查结果显示，在世界范围内恶性肿瘤的死亡率呈现持续上升趋势。据联合国统计数据显示，2014年全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症，这比艾滋病、结核病和疟疾导致的死亡人数总和还要高，每年全球还有1000多万人被确诊患上癌症。近20年，我国的恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，目前国内多数医院收治的肿瘤患者中，以中晚期居多，并且治愈率较低,死亡率高，给我国的社会和医疗带来沉重的负担。虽然对细胞癌变的机制的认识在不断深入，然而人们在控制癌症的征途中步履维艰，进展缓慢，人类将面临着防治恶性肿瘤的新挑战。因此,实现癌症的早期诊断对于有效治疗和改善预后转归尤为重要[1]。寻找新的抗癌药物和探讨其分子机制是目前癌症防治措施研究的重点。

很多研究都证实，桑树中抗癌主要成分是黄酮类化合物，这些黄酮类化合物中，桑根酮C(Sanggenon C)含量较高。目前桑根酮C药理学研究被证实具有明显的降压、抗炎作用，但其抗癌作用方面研究鲜有报道。国外仅研究了桑根酮C对PKC、ODC和COX-1等癌症相关因子有抑制作用[2-4]，而国内目前主要研究其提取工艺[5]。在国内外研究的基础之上，本文研究了桑根酮 C体内体外抗肿瘤作用，旨在探究桑树中抗癌活性成分，为临床癌症治疗提供手段和理论依据，为新疆药用植物桑的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

桑根酮C(SC,宝鸡市辰光生物科技有限公司)，5-氟尿嘧啶(美仑生物)，1640(HyClone)，PBS，0.4%SRB溶液，胰蛋白酶(BOSTRE)，B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞、小鼠肝癌细胞H22由石河子大学药学院药理系提供,昆明种小鼠由石河子大学实验动物中心提供。

1.2 细胞培养

B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞培养于含10%胎牛血清和1%的双抗RPMI1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。收集对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞增殖测定

1×104个肿瘤细胞(B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞)接种于96孔板内，24 h后，用不同浓度的桑根酮C (5、10、20、40、80 μmol/L)处理肿瘤细胞48 h。采用SRB法检测细胞增殖的变化。

1.4 黑色素含量的测定

接种对数生长期的B16F0、B16F10细胞以每孔1.0×105铺于6孔板，加入B16F0的SC终浓度为20、40、80 μmol/L；加入B16F10的SC终浓度为60、80、100 μmol/L。桑根酮C处理细胞24 h，收集细胞于离心管内，用PBS洗一次一并倒入离心管，3500 r/min离心5 min，收集上清液,取1 mL上清液加入1 mL 0.4 mol/L HEPES buffer (pH 6.8)和1 mL溶液(乙醚∶乙醇=1∶1)。取下层水相于96孔板内，每组5个平行孔。细胞沉淀计数后加入含10%DMSO-NaOH 1.5 mL于80 ℃煮1 h, 3 500 r/min离心10 min,取上清液铺96孔板，每组5个平行孔。在405 nm波长下测定吸光度(A)，计算黑色素含量。

1.5 对小鼠肝癌细胞移植动物肿瘤生长和脏器指数的影响

取昆明小白鼠，制备H22小鼠肝癌细胞悬液，每只小鼠腋窝皮下接种2×106/mL的细胞悬液(0.2 mL/只)，将实验动物随机分成5组，分别为模型组、5-FU(20 mg/kg)阳性对照组、桑根酮C的低 (12.5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)3个剂量组。

在接种后第1天开始，均采取腹腔注射给药，连续处理10 d。末次给药24 h后，处死动物，剥离瘤组织并称重，剥取心、肝、肾、脾等脏器并称重，计算抑瘤率和脏器指数变化。

1.6 数据分析

2 结果

2.1 肿瘤细胞增殖抑制作用

5～80 μmol/L的桑根酮C有明显抑制B16F0、B16F10、HepG2细胞增殖作用(图1)，尤其抑制HepG2作用最为明显，细胞的IC50值分别为59.08±0.04、130.17±0.03、50.58±0.03 μmol/L。由结果可知，HepG2细胞对桑根酮C最敏感。

注：与空白组比较, * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001图1 桑根酮C抑制细胞增殖Fig.1 The proliferative inhibition of sanggenon C on cancer cells n=3)

2.2 细胞内、外黑色素含量的测定

当B16F0与SC作用时，与未加药的B16F0细胞对比，20、40、80 μmol/L的SC能使B16F0细胞黑色素生成增加，且呈剂量依赖性(图2)。细胞外黑色素含量与对照组相比，分别为对照组的2.43±0.06倍，3.72±0.03倍，6.74±0.07倍；细胞内黑色素含量与对照组相比，分别为对照组的3.10±0.40倍，3.95±0.46倍，7.92±0.89倍。经统计学计算，20、40、80 μmol/L药物处理组较未加药组有极显著性差异(P<0.01)。

相同浓度的SC作用于B16F10细胞后，与未加药的B16F10细胞对比，SC能使B16F10细胞黑色素生成增加，且呈剂量依赖性(图2)。细胞外黑色素含量与对照组相比，分别为对照组的1.22±0.03、1.90±0.01、4.26±0.09倍；细胞内黑色素含量与对照组相比，分别约为对照组的1.18±0.04、1.50±0.03、1.97±0.03倍。经统计学处理，80、100 μmol/L组较未加药组有极显著性差异(P<0.01)，60 μmol/L组较未加药组有显著性差异(P<0.05)。

注：与空白组比较, *P<0.05, ** P<0.01图2 桑根酮C抑制细胞增殖Fig.2 Effect of SC on melanin levels in cancer cells n=3)

2.3 桑根酮C抑制小鼠H22移植瘤的生长

建立小鼠H22肿瘤模型,腹腔注射给药，给药期间小鼠对药物耐受性良好，体重变化不大。

桑根酮C各组小鼠体重与空白对照组相比无显著性差异，表明桑根酮C对小鼠的生长无明显影响(表1)。

桑根酮C高中低3个剂量组均对H22荷瘤小鼠肿瘤生长产生抑制作用，抑制率为35.01%～47.65%，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)，且在该剂量范围内呈现一定的量效关系(图3)。

表1 桑根酮C对荷瘤小鼠体重和瘤重的影响Tab.1 The effect of Sangenone C on the tumor growth and body weight of H22 mice

注：与对照组比较，**P<0.01,*P<0.05。

注：**P<0.01,*P<0.05图3 桑根酮C对小鼠H22移植瘤生长的抑制作用与模型组比较Fig.3 inhibitory effect of sanggenon C on H22 tumor of mice

2.4 桑根酮C对荷瘤小鼠脏器指数的影响

肝的脏器系数显示(图4)，桑根酮C高中低剂量组均小于阳性对照组，与空白组比较有统计学意义(P<0.01)；其肾脏指数与阳性对照组、空白组比较没有显著性差异；桑根酮C对心脏的作用(图4)，高中低剂量组与空白组、阳性对照组比较没有显著性差异。

脾脏系数变化结果显示(图4)，高、中、低3个剂量的脾脏系数比空白组大，而比模型组小。低剂量组与空白组比较，有统计学意义(P<0.05)。毒理学中,脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等，脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变[6-7]。通过以上分析可见，桑根酮C对小鼠脾脏、心脏、肾脏毒性比5-FU组小。

图4 桑根酮C对荷瘤小鼠脏器指数的影响Fig.4 Effect of Sanggenon C on viscera index in mice with tumor

3 讨论

恶性肿瘤严重威胁着人类健康和生命，已成为人类死亡的第一杀手。近几十年，国内外恶性肿瘤的发病率和死亡率呈现上升趋势。癌症的治疗手段主要是手术切除、放疗、化疗。虽然治疗手段多，但化疗药物是必不可少的。对于较早期未扩散或转移的癌灶，采用手术切除或放疗较为成功，但对于晚期的肿瘤患者治疗效果不大；而且放疗、化疗在杀死癌细胞的同时，也会杀死增殖旺盛的正常细胞，会导致呕吐、腹泻、脱发和骨髓抑制等不良反应，严重影响了患者的生活。目前临床采用的化疗药物带来的不良反应重、多，而且容易耐药，导致预后效果差。由于常用的抗肿瘤药物毒性大，选择性差，在应用中受到很大的限制，从而影响了药物的疗效。因此迫切需要寻找一种新的低毒的药物和方法治疗肿瘤。

桑根酮C是一类黄酮类化合物，存在于从桑科植物桑白皮中[6-8]。桑白皮为桑科植物桑的干燥根皮，具有抗癌、抗炎、降血压、降血糖、和抗动脉粥样硬化药理作用，临床可用于治疗前列腺癌、高血压，高血脂和高血糖等疾病[9-13]。桑白皮的甲醇提取物可通过抑制NF-ΚB的衰减从而诱导人宫颈癌细胞的凋亡，而且可以靶向杀灭肿瘤干细胞[14]，桑根酮C是桑根酮中含量高活性强的成分，可以作为候选抗癌药物使用。

本研究通过观察桑根酮C对肿瘤细胞增殖的影响，发现该化合物能显著抑制黑色素瘤和肝癌细胞的生长和增殖。同时通过考察桑根酮C 对移植瘤小鼠动物模型的影响，结果表明该化合物不仅能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，而且对小鼠的体重、生长几乎没有影响。桑根酮C作用于B16F10、B16F0细胞时，结果显示使细胞外黑色素生成增加，而且较未加药组有极显著性差异，说明桑根酮C具有抑制黑色素瘤的作用。桑根酮C对小鼠的脏器指数的影响结果显示，与模型组比较，对脏器指数的影响很小；与阳性对照组比较，脏器毒性也很小。由以上结果可知，桑根酮C具有良好的体内外抗肿瘤作用。本研究未涉及桑根酮C抗肿瘤作用的机制，需要通过进一步研究探讨，阐明该化合物的作用机制和作用靶点，为该化合物的药用开发提供依据。本研究还需进一步深入考察该化合物毒性反应及体内过程，为寻找新的高效低毒抗癌药物奠定基础。