CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗内源激素含量的影响

2019-09-05王振东鲁晓燕涂文文王晓丽何晨晨

石河子大学学报（自然科学版） 2019年4期

王振东，鲁晓燕，涂文文，王晓丽，何晨晨

(1石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室, 新疆石河子832003)

新疆枣产业的发展突飞猛进[1]，截至2016年底，新疆枣树种植总面积504511公顷[2]。很多枣园土壤盐碱性过强，土地盐碱化严重影响着新疆枣产业的发展[3]。枣的耐盐性取决于砧木，新疆栽培枣大多数都以酸枣(ZiziphusacidojujubaC.Y.Cheng et M.J.Liu)为砧木[4]，研究酸枣的耐盐机制，对利用盐碱地发展枣产业具有重要意义。植物激素在植物适应变化环境的能力中起着中心作用[5]。在植物遭受逆境胁迫时,植物激素被认为是参与调节植物发育和包括盐胁迫在内的各种胁迫的耐受或易感性的重要内源因子[6-7]。植物内源激素以协同调节植物的生长发育及对逆境的适应，植物组织中激素水平的变化被认为是控制由于盐度引起的生长减少的一个初始过程[8]。

Ca2+是一种信使分子，能介导植物对外界信号的刺激反应，调节植物多种生理过程[9]；Ca2+对5种已知的植物激素的功能都有强烈的修饰效应，Ca2+或者加强某些激索的生理效应，或者抑制一些激素的效应[10-12]，所以研究外源钙处理下植物体内内源激素在盐胁迫下动态变化有重要意义。

为了进一步探讨CaCl2在酸枣适应NaCl胁迫中的作用，本文在前期工作[13]基础上研究CaCl2对 NaCl 胁迫下酸枣幼苗叶和根生长素(growth substance，IAA)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、玉米素(zeatin，ZT)含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其处理

试验于2018年3月到10月进行，挑选大小一致的酸枣种子，用0.5% KMnO4消毒30 min后放入发芽盒，置于人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)中闭光催芽，待幼苗长出2片真叶后，选择生长健壮、整齐一致的幼苗用2 cm厚的泡沫板悬浮于水培盒中置于人工气候箱(光照强度12000 lx，光照时间14 h，黑暗时间10 h；相对湿度65%～70%；温度25～28 ℃)。其中，水培盒大小为19 cm×13 cm×11 cm(长×宽×高)，每个水培盒加1倍日本园试配方营养液500 mL，每3 d更换一次营养液。

幼苗长到6片真叶完全展开时，开始以下4种处理：(1)Na处理(CK)：日本园试配方营养液 + 150 mmol/LNaCl；(2)Na+ 5Ca处理：日本园试配方营养液 + 150 mmol/L NaCl + 5 mmol/L CaCl2；(3)Na+ 10Ca处理：日本园试配方营养液+150 mmol/L NaCl + 10 mmol/L CaCl2；(4)Na+ 20Ca处理：日本园试配方营养液 + 150 mmol/L NaCl + 20 mmol/L CaCl2。每个处理重复6次，每个重复15株幼苗。为避免盐激反应，Na处理和Na+ Ca处理中，NaCl浓度以每天50 mmol/L的梯度逐步递增，全部处理于同一天达到目标浓度，此时设为第0 h，分别在0、6、12、24、48、96 h时采样，每次选取15株苗，混合叶片(叶片要完全展开)和根系进行随机取样，分6次全部取完。每个器官设置3个重复，取样后立即放入液氮中，放入超低温冰箱(-80 ℃)中保存，待用于激素含量的测定。

1.2 HPLC 流动相的选择

高效液相色谱仪(LC-2010AHT，日本岛津)，离心机(HITACHI，CR22GIE)，旋转蒸发器(RE-2000 A)。ZT、GA3、IAA、ABA标准品购自Sigma公司，乙酸乙酯、甲醇、乙酸为色谱级，盐酸、磷酸氢二钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)为分析纯，实验用水为超纯水。使用0.45 um微孔滤膜过滤所有试剂使用。

HPLC条件如下：AgilentC18ZORBAX反向色谱柱(150 mm×46 mm，5 μm)；柱温35 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；采用切换波长法以外标法进行定量测定；流动相V(甲醇)∶V(超纯水含1%乙酸)=48∶52。

1.3 标准品的配置

分别称取0.005 g ZT、0.01 g IAA、0.125 g GA3和0.005 g ABA标准品，用纯甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶，即为4种激素混合标准溶液。以混合标准溶液为母液，逐级稀释，配制成含有ZT、GA3、IAA和ABA的系列标准溶液，采用优化的色谱条件，依次进样检测，以激素质量浓度(ng/ml)为横坐标，以峰面积(mAU)为纵坐标，建立4种激素的回归方程。

标准曲线的绘制过程如下：用50 mL 100%甲醇溶解激素混合标准溶液，吸取25 mL上述混合标准品溶液加入25 mL甲醇稀释，依次吸取前一步标准品溶液加入25 mL甲醇稀释，依次稀释3次，形成5个浓度，测出每个浓度的峰面积，从而计算出各个激素含量，绘制标准曲线。

1.4 测定指标和方法

准确称取0.2 g冷藏的酸枣材料，加入10 mL预冷的80%甲醇和液氮研磨成匀浆，密封后置于4 ℃冰箱静置不同时间；4 ℃条件下离心10 min后取上清液，残渣加入80%甲醇离心重复3次合并上清液，将全部的上清液于40 ℃条件下旋蒸至原体积的三分之一, 将余下的提取液调至pH=8，加入30 mL的石油醚脱色3次，弃醚相，再加入0.1 g的PVPP震荡后过滤；再调整滤液pH=3，加20 mL乙酸乙酯重复萃取4次合并酯相，在40 ℃条件下减压蒸干，残留物加2 mL的乙酸溶解3次后将溶解液过sep-pak18小柱纯化，用甲醇洗脱后减压蒸干，用80%甲醇溶解定容至2 mL溶液过0.22 μm的微孔滤膜后HPLC分析。

1.5 数据统计分析

试验数据用SPSS19进行分析，多重比较采用Duncan，s新复极差法，用Microsoft Excel 2016进行数据处理，作图软件使用 Origin2018。

2 结果与分析

2.1 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根IAA含量的影响

结果(图1)显示:

(1)与CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理各时间点酸枣幼苗叶和根中IAA含量均显著高于CK；在48 h，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理酸枣幼苗叶中IAA含量分别是CK的1.45、1.37、1.25倍，酸枣幼苗根IAA含量分别是CK的1.56、1.56、1.15倍。

(2)与0 h相比，CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理酸枣幼苗叶和根中IAA含量随着处理时间的延长呈现下降的趋势；在96 h，叶中IAA含量分别下降41.65%、39.04%、37.12%、41.85%，根中IAA含量分别下降49.47%、29.78%、43.64%、55.36%。

不同小写字母表示同一时间不同浓度间的显著水平(P<0.05，n=3)，不同大写字母表示同一浓度不同时间点的显著水平(P<0.05，n=3)图1 CaCl2处理对酸枣幼苗叶和根IAA含量的影响Fig.1 Effect of CaCl2 treatment on IAA content in leaves and roots of jujube jujube seedlings(Different lower-case letters indicate significant levels between different concentrations at the same time (P< 0.05, n=3), and different upper-case letters indicate significant levels at different time points at the same concentration (P< 0.05, n=3)

2.2 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根GA3含量的影响

结果(图2)显示:

(1)与CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理各时间点酸枣幼苗叶和根中GA3含量均显著高于CK；在48 h，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理酸枣幼苗叶中GA3含量分别是CK的2.14、2.08、1.58倍，酸枣幼苗根中GA3含量分别是CK的2.44、2.26、1.42倍。

(2)与0 h相比，CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这4种处理酸枣幼苗叶和根中GA3含量都随着处理时间的延长呈现下降的趋势；在96 h，叶中GA3含量分别下降83.12%、43.56%、49.42%、72.82%，根中GA3含量分别下降75.90%、42.95%、47.85%、68.31%。

图2 CaCl2处理对酸枣幼苗叶和根GA3含量的影响Fig.2 Effect of CaCl2 treatment on the content of GA3 in leaves and roots of jujube jujube seedlings

2.3 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根ZT含量的影响

结果(图3)显示:

(1)与CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理6、12、24、48、96 h酸枣幼苗叶中ZT含量均显著高于CK；酸枣幼苗根中ZT含量在12、24、48、96 h显著低于对照；在48 h，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理酸枣幼苗叶中ZT含量分别是CK的1.11、1.12、1.04倍，酸枣幼苗根中ZT含量分别是CK的0.94、0.91、0.83倍。

(2)与0 h相比，在CK、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理酸枣幼苗叶和根中ZT含量都随着处理时间的延长呈现下降的趋势；在96 h，叶中ZT含量分别下降了45.97%、24.46%、40.30%、43.05%，根中ZT含量分别下降了1.88%、34.18%、31.76%、38.31%。

图3 CaCl2处理对酸枣幼苗叶和根ZT含量的影响Fig.3 Effect of CaCl2 treatment on ZT content in leaves and roots of jujube jujube seedlings

2.4 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根ABA含量的影响

结果(图4)显示:

(1)与对照相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理0、6、12、24、48 h酸枣幼苗叶和根中ABA含量均显著低于CK；在48 h，酸枣幼苗叶中ABA含s量分别是CK的0.65、0.67、0.81倍，酸枣幼苗根中ABA含量分别是CK的0.60、0.65、0.88倍。

(2)与0 h相比, 在CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这4种处理下酸枣幼苗叶和根的ABA含量都随着处理时间的延长呈现上升的趋势；在96 h，酸枣幼苗叶中ABA含量分别是0 h的1.70、1.65、3.87、2.41倍，根ABA含量分别是0 h的2.02、2.34、2.094、4.06倍。

图4 CaCl2处理对酸枣幼苗叶和根ABA含量的影响Fig.4 Effects of CaCl2 on ABA concentrations in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.5 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根ZT/ABA比值的影响

结果(图5)显示:

(1)与CK相比，Na+5Ca、Na+10Ca这2种处理各时间点酸枣幼苗叶中ZT/ABA 比值均显著高于CK，Na+20Ca处理12、24、48、96 h酸枣幼苗叶中ZT/ABA 比值与CK无显著差异；Na+5Ca、Na+10Ca这2种处理0、6、12、48、96 h酸枣幼苗根中ZT/ABA 比值显著高于CK；Na+20Ca处理0、6、12 h酸枣幼苗根中ZT/ABA 比值显著高于CK，在24、48、96 h根中ZT/ABA 比值与CK无显著差异。

(2)与0 h相比, CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+ 20Ca这4种处理酸枣幼苗叶和根ZT/ABA的比值都随处理时间的延长呈显著降低趋势；在96 h，酸枣幼苗叶中ZT/ABA 比值分别下降了67.87%、54.10%、84.65%、76.94%，根中ZT/ABA 比值分别下降了51.70%、71.94%、67.49%、84.88%。

图5 CaCl2处理对酸枣幼苗叶和根ZT/ABA的比值的影响Fig.5 Effect of CaCl2 treatment on ZT/ABA ratio of leaves and roots of jujube jujube seedlings

2.6 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根IAA/ABA比值的影响

结果(图6)显示:

(1)与对照相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理各时间点酸枣幼苗叶中IAA/ABA 比值均显著高于CK；Na+5Ca和Na+10Ca这2种处理各时间点酸枣幼苗根中IAA/ABA 比值均显著高于CK；Na+20Ca处理0、6、12、24 h酸枣幼苗根中IAA/ABA 比值显著高于CK，在48、96 h根中IAA/ABA的比值与CK无显著差异。

(2)与0 h相比, CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这4种处理酸枣幼苗叶和根IAA/ABA的比值都随时间延长呈显著降低趋势；在96 h，酸枣幼苗叶中IAA/ABA 比值分别下降了65.21%、69.93%、83.84%、75.90%，根中IAA/ABA 比值分别下降了75.26%、69.93%、73.14%、75.90%。

2.7 CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶、根GA3/ABA比值的影响

结果(图7)显示:

(1)与对照相比，Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这3种处理各时间点酸枣幼苗叶中GA3/ABA的比值均显著高于CK；Na+5Ca和Na+10Ca这2种处理在各时间点酸枣幼苗根中GA3/ABA 比值均显著高于CK；Na+20Ca处理0、6、12、24 h酸枣幼苗根中GA3/ABA 比值显著高于CK，在48、96 h根中GA3/ABA 比值与CK无显著差异。

(2)与0 h相比, CK、Na+5Ca、Na+10Ca和Na+20Ca这4种处理酸枣幼苗叶和根中GA3/ABA 比值都随处理时间延长呈显著降低趋势；在96 h，叶中GA3/ABA比值分别下降了88.09%、75.60%、75.09%、92.45%，根GA3/ABA比值分别下降了89.96%、65.69%、86.93%、88.72%。

图7 CaCl2处理对酸枣幼苗叶和根GA3/ABA的比值的影响Fig.7 Effect of CaCl2 treatment on the ratio of GA3/ABA between leaves and roots of jujube jujube seedlings

3 讨论

(1)ABA作为一种胁迫激素,在干旱和盐胁迫中的作用至少有两个方面：水平衡和细胞脱水耐受性,并在调节植物的气孔行为和气体交换中起着重要作用[14-15]。前人研究已表明，盐和干旱会引起的植物ABA含量增加[16]；郭秀林等发现不同钙离子螯合剂、EGTA、Vp等处理皆能促进根和叶片ABA含量的提高[17]，而添加外源Ca(N03)2的可以降低ABA水平[18]；本文研究表明，Na+10Ca、Na+10Ca处理酸枣ABA含量显著低于对照，而Na+20Ca处理在NaCl胁迫随着下时间的延长ABA含量大幅增加，但是由于其ABA累积的量比对照少，仍然减轻了酸枣的盐害；3种不同浓度CaCl2处理降低了酸枣幼苗叶和根中ABA的含量，减少了ABA对生长的抑制作用，缓解了盐胁迫的毒害作用，从而减轻了盐害。

(2)ABA还与其它植物激素一起调节植物生长和发育，ZT、GA3、IAA等在植物遭受逆境胁迫时也起重要作用。细胞分裂素主要在根系中产生，盐胁迫下根中细胞分裂素合成量减少，进而使植物其它器官细胞分裂素含量降低[19]。本研究发现不同浓度CaCl2处理下叶中ZT含量高于对照，而根中则相反，可能是外源CaCl2处理可以使酸枣幼苗在NaCl胁迫下使根部合成的ZT快速向叶中转移，从而更好的协调激素间的平衡，有利于酸枣幼苗在盐害中生存。

水分胁迫下甘薯植株体内 IAA、GA3和 ZR 等激素含量降低，而ABA含量增加[20]；杨树在NaCl胁迫下，随着NaCI胁迫浓度的增加，IAA/ABA、GA3/ABA比值越低, 受盐胁迫程度越大[21]；本文研究表明，在150 mmol/L NaCl胁迫下，酸枣幼苗通过降低叶和根中IAA/ABA、GA3/ABA和ZT/ABA比值的方式来调节自身的激素平衡以此来适应外界NaCl胁迫环境；5、10 mmol/L10 CaCl2处理酸枣幼苗叶和根IAA/ABA、GA3/ABA和ZT/ABA比值显著高于对照，这进一步说明外源CaCl2处理下NaCl胁迫酸枣幼苗可以调节自身的激素平衡以适应外界盐胁迫的能力强于对照，其幼苗受NaCI胁迫抑制作用较小。

(3)Ca2+作为第二信使，参与了植物激素信号转导，在逆境生理方面都起着重要的作用[9,12]。盐胁迫会破坏质膜的完整性，抑制Ca2+的吸收和利用[22]。补充适量的外源Ca2+对于维持细胞膜的稳定性和提高植物对盐度的抵抗力是极为重要的[23-25]。草莓在盐胁迫下，在缺钙及钙调素抑制剂TFP处理中，草莓内源激素含量的变化趋势与加钙处理相反，证明ABA及其它激素含量在盐胁迫条件下的变化受钙信号调节[18]。

本研究显示，CaCl2处理对酸枣在NaCl胁迫情况下均有一定的缓解作用，有效抑制了ABA含量的增加，提高了CTK、GA、IAA的水平；3种浓度CaCl2处理下酸枣体内激素水平表现出差异，Na+5Ca处理缓解效果最好，Na+10Ca其次，Na+20Ca缓解效果最差，随着CaCl2浓度的升高，其缓解效果反而下降，而且随着处理时间的延长，高浓度钙处理叶片和根系中内源激素ZT(根除外)、GA3、IAA水平下降幅度接近对照，原因可能是盐胁迫会对酸枣的细胞造成损害, 酸枣所需要的Ca2+减少,所以使用适量的外源钙可以增强酸枣的抗盐能力，过量的外源Ca2+可能会导致离子胁迫，加重酸枣受到的盐害。