宁夏密点麻蜥不同部位含药大鼠血清对人胃癌细胞凋亡的影响研究

李卫强，王 骄，关 芳，艾梦环

1宁夏医科大学中医学院；2宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，银川750004

胃癌是一个多基因、多阶段、多因素参与的病理过程，多数学者认为肠型胃癌发生遵循从慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一过程[1]。从正常胃黏膜到胃癌的发展过程中，细胞凋亡渐受抑制，细胞恶性增生逐渐显现。因此，胃黏膜细胞凋亡较少是胃癌发生的重要机制，而如何促进细胞凋亡、抑制增殖是阻断肿瘤发生的关键环节。我们采用宁夏密点麻蜥为主的复方蜥蜴散治疗慢性萎缩性胃炎、胃癌前病变及胃癌，均取得较好的临床疗效。同时，前期通过复方蜥蜴散及单味宁夏密点麻蜥干预胃癌细胞的体外实验研究也表明，该方及单味密点麻蜥可改善胃黏膜细胞缺血缺氧的微环境，促进细胞凋亡，阻断癌变[2-8]。本实验即在以上研究的基础上，进一步研究宁夏密点麻蜥不同部位对人胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响及其机制，以期为深入探究密点麻蜥抗癌物质基础提供科学依据。

1 材料

1.1 动物和试剂

4～6周龄雄性SD大鼠120只，SPF级，体重150～180 g，合格证号SCXK(宁)2015-0001，大鼠生长繁殖饲料(No.18053223，北京科澳协力饲料公司)，大鼠和饲料均由宁夏医科大学实验动物中心提供。RMPI-1640培养基、胎牛血清(Gibco公司)；MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份公司，No.20171213)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司，NO：BB17091)；兔抗P53多克隆抗体、兔抗SIRT1单克隆抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司)。人胃腺癌细胞株SGC-7901(中科院上海生科院细胞资源中心提供)。

1.2 药物

宁夏密点麻蜥由宁夏医科大学附属回医中医医院提供，分别制备其头部、四肢部、躯干部、尾部及全身组，按照人鼠之间用量比例折算，配成浓度为0.28 g/mL水煎液装瓶备用；0.9%氯化钠注射液(湖南科伦制药公司，No.D17090607-1)。

1.3 仪器

超净工作台(苏州安泰公司)；HealForce二氧化碳培养箱(香港力康公司)；OLYMPUS显微镜BH-2RFCA；BIO-TEK酶标仪ELx800型等。

2 方法

2.1 含药血清制备

120只SPF级SD大鼠适应性喂养7天后，随机分6组：生理盐水对照组、宁夏密点麻蜥头部组、四肢部组、躯干部组、尾部组、全身组，每组20只。按每只2.5 mL/100 g给药，对照组给予等量生理盐水，连续灌胃7天。末次给药1 h后，腹腔麻醉，腹主动脉取血、离心，制备含药血清，-20 ℃冷藏备用。

2.2 胃癌细胞培养

生长于RMPI-1640培养液中的人胃癌细胞SGC-7901，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，每隔48 h更换 1次培养基；实验时，消化并接种于96孔板或6孔板培养皿中。

2.3 MTT检测细胞增殖

将对数生长期细胞分别以2×103个/mL浓度接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液。培养24 h后吸去上清液，按照实验分组分别加入用RPMI1640培养液配置的含10%药物血清100 μL，每组均做5个复孔。各组细胞分别培养24 h，每孔加入50 μL的1xMTT。继续培养4 h后，吸去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡仪振荡10 min，待结晶物充分溶解后，用酶标仪在490 nm波长下测吸光值。

2.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

对数生长期细胞分别以6×105/mL接种于6孔板，培养24 h，待细胞贴壁后，吸去上清液，加入含10%大鼠血清的培养液，继续培养24 h，PBS清洗细胞1次，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，进行4 ℃ 2 000 rmp，离心5 min，弃上清，冷PBS洗涤细胞2次，吸尽PBS，用400 μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混匀后2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μ LPI染色液，混匀于28 ℃避光条件下孵育5 min，以流式细胞定量分析。

2.5 Western-blot检测Sirt1和P53蛋白表达

用含10%大鼠含药血清的RPMI-1640培养液，转染对应各组细胞72 h后收集细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取25 μg样品上样于十二烷基硫酸钠-上样缓冲液(SDS-PAGE)，电泳至溴酚蓝跑到胶底部。将其转至硝酸纤维脂膜上，以5%脱脂奶粉4 ℃过夜封闭；分别加入Sirt1和P53一抗，摇床孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，分别加入二抗，摇床孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，进行图像采集，计算Sirt1和P53蛋白与内参p-actin灰度值的比值，重复3次。

2.6 统计分析

SPSS 20.0 For Windows统计分析。对数据进行正态分布检验，符合正态分布者采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)的最小显著差法，不符合正态分布者进行数据转化后比较，结果以均数±标准差表示(显著性水准取α=0.05)。

3 结果

3.1 宁夏密点麻蜥不同部位含药大鼠血清干预后各组吸光度(OD)值

宁夏密点麻蜥各组OD值低于生理盐水对照组，P<0.05，表明密点麻蜥各组可较好抑制胃癌细胞增殖；宁夏密点麻蜥各组间比较，以尾部组OD值最低，P<0.05，说明尾部组对胃癌细胞增殖的抑制作用最强(见表1)。

表1 宁夏密点麻蜥不同部位各组含药血清干预后OD值

注：*各组与生理盐水对照组比较，*P<0.05；★各组与尾部组比较，★P<0.05。

Note:Compared with control group of saline,*P<0.05;Compared with tail group,★P<0.05。

3.2 宁夏密点麻蜥不同部位含药大鼠血清对SGC-7901胃癌细胞凋亡影响

宁夏密点麻蜥各组促进人胃癌细胞的总凋亡率高于生理盐水对照组，P<0.05，表明密点麻蜥各组可较好促进胃癌细胞凋亡；宁夏密点麻蜥各组间比较，以尾部组总凋亡率最高，P<0.05，说明尾部组促进胃癌细胞凋亡的作用最强(见表2、图1)。

3.3 Western blot检测STIR1和P53蛋白表达

从图2可知，与生理盐水对照组比较，各含药血清处理组Sirt1和P53蛋白表达均降低，P<0.05。图3、图4中Western blot检测结果表明，宁夏密点麻蜥尾部组Sirt1和P53蛋白水平下降最明显，各组比较，P<0.05。

3 讨论

胃癌属“胃脘痛”“伏粱”“噎膈”“积聚”等范畴。中医学认为，饮食、情绪失调及Hp湿热“虫”毒感染等引起脾胃升清降浊功能失常，气血生化乏源，胃黏膜失却濡养，久则浊毒稽留，络脉瘀阻而致癌病形成。因此，我们结合文献及临床研究，提出毒瘀交阻、气阴不足是胃癌的主要病机，此与现代医学细胞缺血缺氧微环境改变而致细胞凋亡失常、细胞恶性增殖致胃癌发生的病理相一致。

因此，促进细胞凋亡、抑制恶性增殖是阻断肿瘤发生的关键环节。现代胃癌机制研究主要集中在能够引起细胞增殖、分化的基因和蛋白质表达上[9,10]，如SIRT1、P38、P53、Stats通路、Wnt通路、survivin-caspase-3基因表达、NF-κB等。而SIRT1调控的P53及P53正向细胞凋亡调控因子 (P53 up-regulatedmodulator of apoptosis protein，PUMA)，也称为bcl-2 binding component 3 protein(BBC3)，因作用独特、促凋亡活性强大而受到越来越多的关注，在胃癌阻断机制中起重要的调控作用[11-13]。

表2 宁夏密点麻蜥不同部位含药大鼠血清对胃癌细胞凋亡影响

注：*各组与生理盐水对照组比较，*P<0.05；★各组与尾部组比较，★P<0.05。

Note:Compared with control group of saline,*P<0.05;Compared with tail group,★P<0.05。

图1 宁夏密点麻蜥不同部位含药大鼠血清对胃癌细胞凋亡影响Fig.1 Effect of drug containing rats serum in lizard’s different parts on apoptosis of gastric cancer cells

图2 Sirt1 and P53蛋白表达Fig.2 Sirt1 and P53 expression levels注：A对照组；B头部组；C四肢组；D躯干组；E全身组；F尾部组。Note:A.control group;B.head group;C.limb group;D.trunk group;E.body group;F.tail group.

目前，发现人类sirtuin家族成员有7个，SIRT1是与酵母Sir2基因同源性最高的一个参与细胞衰老、凋亡、分化等生理活动，可能是所有生物共有的寿命调节基因之一[14]。研究表明，SIRT1作用底物中P53是很重要的一个。P53是目前研究最多的抑癌基因，发生变异者为突变体，不但丧失抑癌活性，反而可促进恶性转化，由抑癌基因转变为癌基因。已经证实，当细胞处于缺血缺氧致使DNA损伤等应激情况时，P53蛋白表达与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后有关。同时，P53过度表达又可导致肿瘤血管生成增加，是与血瘀证相关的重要因子[15]。

我们前期开展了蜥蜴相关文献研究，李时珍《本草纲目》载蜥蜴可“滑窍破血，消水饮阴”，《中药大辞典》亦指出，蜥蜴具有破结利水、消瘿散结之效，表明其功效与毒瘀交阻的胃癌病机相符合，临床以蜥蜴胃康方治疗胃癌前病变疗效显著。此外，通过宁夏密点麻蜥干预胃癌前病变(PLGC)模型大鼠的实验研究表明，宁夏密点麻蜥能抑制PLGC模型大鼠HIF-1α和VEGF表达，可改善胃黏膜细胞缺血缺氧的微环境，抑制凋亡相关蛋白P53、PUMA表达,可有效逆转胃黏膜增生肠化,抑制癌变趋势，具有较好的生物活性。进而我们以宁夏密点麻蜥含药大鼠血清干预人胃癌细胞，发现其能升高P53、Bax及E-cad蛋白表达水平,降低MMP-9蛋白表达,抑制人胃癌细胞BCG-823细胞增殖,促进细胞凋亡，阻断癌变，E-cad、MMP-9均为细胞上皮间质转化相关因子，与胃癌浸润转移有关，表明宁夏密点麻蜥可干预胃癌的浸润转移，疗效优于5-FU及华蟾素片组[2-8]。以上研究说明宁夏密点麻蜥具有较好阻断癌变的作用，但其活性部位尚不明确。

宁夏密点麻蜥生活在沙漠中，从临床及前期实验研究结果来看，其生物活性较草原蜥蜴更强，蜥蜴断尾再生表明蜥蜴尾部含有较强的生物活性物质。陈绍军也指出，蜥蜴尾部再生分化对机体有较好的保护和功能恢复作用[16]，但缺乏有力实验数据的支持，基于此，我们进一步开展了宁夏密点麻蜥不同部位抗肿瘤细胞凋亡的研究，以其明确蜥蜴抗肿瘤活性部位，为进一步探讨其抗肿瘤活性物质基础奠定基础。

本实验研究结果表明，宁夏密点麻蜥不同部位各组可明显抑制SGC-7901胃癌细胞增殖，诱导凋亡，以尾部组吸光度值小于其他组，P<0.05。各含药大鼠血清干预组细胞总凋亡率大于生理盐水对照组，宁夏密点麻蜥尾部组细胞总凋亡率大于其他各组，宁夏密点麻蜥不同部位含药大鼠血清干预组Sirt1和P53蛋白表达各组比较，P<0.05，以尾部组下降最明显，P<0.05。表明宁夏密点麻蜥尾部干预人胃癌细胞SGC-7901细胞增殖，诱导凋亡，以尾部组作用最强，表明尾部为蜥蜴抗肿瘤活性最强的部位，含有较多的活性成分，其机制可能与解毒通络、养血活血，改善胃黏膜营养供给，改变缺血缺氧微环境，进而抑制Sirt1，降低P53蛋白表达有关，这为我们下一步研究宁夏密点麻蜥尾部抗癌活性成分提供了科学依据。