牡丹花黄酮的超声辅助提取工艺研究

窦勇博，王成忠

（齐鲁工业大学＜山东省科学院＞食品科学与工程学院，山东济南250353）

牡丹属芍药科植物，原产中国西部秦岭和大巴山一带，为多年生落叶小灌木。牡丹生长慢、株型小，是我国特有的木本名贵花卉，有数千年的自然生长和1 500 多年的人工栽培历史，素有“国色天香”“富贵之花”“花中之王”等美称。牡丹花具有重要的药用价值，含有紫云英苷、没食子酸、苯甲酸等黄酮、多酚化合物[1]。黄酮类化合物（flavonoids）又称黄体酮、生物类黄酮、黄碱素、维生素P，泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。近年来随着对黄酮类化合物研究的不断深入，许多天然黄酮类化合物被开发出来，发现其对机体有许多生理活性，如清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗肿瘤、抗过敏、抗菌、抗炎、抑制酶的活性、防止血管舒张等作用[2,3]。另外，黄酮类化合物在食品医药领域的应用前景也非常广阔[4,5]。在牡丹花黄酮的提取方面，目前研究还非常少。王晓等[6]研究了酶法提取牡丹总黄酮的工艺条件。王亮生等[7]在研究牡丹花成色机理时，对西北牡丹中的黄酮种类和含量进行了探索。

黄酮类化合物常用的提取方法有水提法、有机溶剂提取法、碱液提取法、微波提取法、超声波提取法、超临界流体萃取、半仿生提取法及酶解法等。用超声波提取法提取黄酮类物质，与普通的有机溶剂提取法相比具有提取效率高、操作方便、温度低、提取时间短等优点[8-10]。本试验使用超声波辅助法提取牡丹花中总黄酮，并通过单因素试验和正交试验优化得到最佳的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

XFB-400 小型植物粉碎机，吉首市中诚制药机械厂；RE100-Pro 旋转蒸发仪，上海人和科学仪器有限公司；UV-1800 紫外可见分光光度计，岛津国际贸易有限公司；SHB-III 水循环真空泵，北京博远祥德科学仪器有限公司；DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；KQ-300DB 数控超声波清洗器，北京卓信伟业科技有限公司；YP3001N 电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HW·SY21-K 电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表有限公司。

1.2 材料与试剂

试验采用菏泽地区栽种的牡丹花，以晒干的牡丹花为原料，烘干后破碎打粉备用。

芦丁，天津大茂化学试剂厂；乙醇，天津大茂化学试剂厂；三氯乙酸（TCA），天津大茂化学试剂厂；所有试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制备

（1）对照品溶液的配制

精确称量芦丁10.0 mg，用70%乙醇溶解，稀释定容至50 mL，配成0.2 mg/mL 的对照品溶液。

（2）显色剂的配制

精密称取AlCl3·6H2O 2.42 g，用70%乙醇定容至100 mL，配成0.1 mol/mL 的显色剂溶液。

（3）绘制标准曲线

从芦丁对照品溶液中精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 溶液，加入1 mL、0.1 mol/L 的显色剂，用70%乙醇定容至25 mL。摇匀，充分显色15 min，在412 nm 处测吸光度。以不加芦丁对照品溶液为对照，制备标准曲线。

1.3.2 样品中黄酮含量的测定

将低温冷冻的牡丹花于50 ℃低温烘干，粉碎机破碎，精确称取一定质量的牡丹花粉末（1.0 g），以一定体积分数的乙醇溶液为溶剂，在一定的料液比下，超声辅助浸提一段时间后，浸提液经抽滤后加入相应浓度的乙醇，定容于100 mL 容量瓶中作为提取液。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L 的显色剂，用70%乙醇定容至25 mL。摇匀，充分显色15 min，在412 nm 处测吸光度，代入回归方程，计算提取液中黄酮的含量[11]。

1.3.3 黄酮不同提取方法的比较

（1）传统浸提法

精确称取牡丹花粉末1.0 g，以70%的乙醇溶液为溶剂，料液比为1：30，在60 ℃恒温水浴中浸提2 h，浸提液经抽滤后定容。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L的显色剂，用70%乙醇定容至25 mL。摇匀，充分显色15 min，在412 nm 处测吸光度，代入回归方程，计算提取液中黄酮的含量。

（2）超声波辅助提取法

精确称取牡丹花粉末1.0 g，以70%的乙醇溶液为溶剂，料液比为1：30，超声辅助浸提30 min，浸提液经抽滤后定容。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L 的显色剂，用70%乙醇定容至25 mL。摇匀，充分显色15 min，412 nm 处测吸光度，代入回归方程，计算提取液中黄酮的含量。

1.4 超声波辅助提取黄酮的单因素试验

1.4.1 乙醇浓度对提取液中黄酮含量的影响

精确称取牡丹花粉末1.0 g，分别以不同体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液为提取溶剂，料液比为1：30，60 ℃、280 W 超声提取40 min，抽滤定容，然后测定黄酮含量。

1.4.2 料液比对提取液中黄酮含量的影响

料液称取牡丹花粉末（1.0 g），以60%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比分别为1：20、1：30、1：40、1：50、1：60，60 ℃、280 W 超声提取40 min，抽滤定容，然后测定黄酮含量。

1.4.3 超声时间对提取液中黄酮含量的影响

准确称取牡丹花粉末（1.0 g），以60%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比为1：30，在60 ℃、280 W 超声波分别超声提取20、30、40、50、60 min，抽滤定容后，测定黄酮含量。

1.4.4 超声温度对提取液中黄酮含量的研究

精密称取牡丹花粉末1.0 g，以60%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比为1：30，分别在40、50、60、70 ℃条件下，280 W 超声提取40 min，抽滤定容后，测定黄酮含量。

1.5 超声波辅助提取黄酮的正交试验

在单因素试验的基础上，进行L9(34)正交试验，试验设计见表1。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的制备

经线性回归，得到溶液浓度（x）与吸光度（y）关系曲线的回归方程为y=36.97x+0.011，R2=0.998。可见，在所试验的浓度范围内，溶液浓度（x）与吸光度（y）呈现良好的线性关系。

2.2 超声波提取法与传统浸提法的对比

表2 超声波提取法与乙醇浸提法的比较Table 2 Comparison between ultrasonic extraction method and ethanol extraction

由表2 可知，超声波提取法牡丹花总黄酮提取率为2.48%，而传统浸提法黄酮的提取率为1.93%，超声波的提取效果比传统浸提法提高了0.55%。在其他条件相同的前提下，超声波法提取时间仅需40 min，与传统浸提法相比，具有省时、提取率高、设备简单等优点。因此，本试验采用超声波辅助法提取牡丹花黄酮。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 乙醇浓度对牡丹花黄酮提取率的影响

图1 显示了乙醇浓度对提取液中黄酮含量的影响，由图可知，随着乙醇溶液浓度的升高，牡丹花总黄酮的提取率不断增加，但当乙醇浓度高于60%时，提取率反而下降。原因可能是天然植物中的黄酮类化合物多以苷类形式存在，而黄酮苷在低浓度乙醇中溶解度较高，在高浓度乙醇中溶解度反而降低，结果导致提取率也随之下降。因此，用于牡丹花黄酮提取的乙醇浓度选择60%。

图1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

2.3.2 料液比对牡丹花黄酮提取率的影响

图2（见下页）显示了料液比对提取液中黄酮含量的影响，由图可知，随着料液比的减小，牡丹花黄酮的提取率不断增加，但当料液比达到1：30 时，提取率接近平稳。原因可能是随着料液比的减小，牡丹花的黄酮不断溶解，但是牡丹花中黄酮含量是有一定限度的，料液比达到1：30 时黄酮基本完全溶出，此时再增加溶剂的用量，提取率的变化不大。因此，料液比选择1：30。

图2 料液比对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.3.3 超声时间对牡丹花黄酮提取率的影响

图3 显示的是超声时间对提取液中黄酮含量的影响。由图可知，随着提取时间的延长，黄酮的提取率逐渐增加，在40 min 时达到最高，之后提取时间再延长，黄酮的提取率呈现逐渐下降趋势。原因是当提取时间过短时，牡丹花黄酮提取的不够充分，没有完全溶出，而时间过长，牡丹花中其他能溶解到乙醇中的化合物也可能被提取出来，从而影响黄酮和铝离子的络合，使吸光度下降。因此，提取时间选择40 min。

图3 提取时间对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids

2.3.4 超声温度对牡丹花黄酮提取率的影响

图4 显示了超声温度对提取液中黄酮含量的影响，由图可以看出，随着提取温度的升高，黄酮的提取率逐渐增加，但当温度上升到60 ℃时，黄酮的提取率最高，再升高温度，黄酮的提取率反而下降。原因是温度过高时可能会导致一部分黄酮发生氧化而分解；同时，会有部分溶剂挥发损失，影响到料液比，从而使提取率降低。因此，提取温度选择60 ℃。

图4 提取温度对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，进行正交试验，结果见表3，方差分析结果见表4。

从表3 中极差分析的结果可以看出，四个因素对牡丹花黄酮提取率的影响顺序依次为乙醇浓度料液比＞提取时间＞提取温度；提取黄酮的最佳条件是A1B2C2D3，即乙醇浓度50%、提取温度60 ℃、提取时间40 min、料液比1：40。经验证试验，该条件下得到的牡丹花黄酮提取率为2.998%，均高于其他试验组。从表4 显著性分析中可以看出FD＞FC＞FB＞FA，且FD远远超过了F 临界值，这表明料液比对提取率有显著性影响，因此采用超声波辅助提取牡丹花黄酮时应特别注意料液比。

3 结论

本文采用超声波辅助提取法提取牡丹花黄酮，优化了提取工艺，确定了牡丹黄酮的最佳提取条件，并在此基础上研究了牡丹黄酮的含量及抗氧化性能。与传统浸提法相比，超声波辅助提取方法具有省时、提取率高、设备简单等优点。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal test results

表4 正交试验方差分析Table 4 The variance analysis of orthogonal test

试验还得到，影响牡丹黄酮的提取效果因素的大小顺序为料液比＞提取时间＞提取温度＞提取溶剂浓度。最佳提取工艺为乙醇浓度50%、提取温度60 ℃、提取时间40 min、料液比1：40。在最佳提取条件下，牡丹花中总黄酮提取率为2.998%。