NOS3基因多态性与血脂、缺血性脑卒中的相关性研究

朱 殊，江顺福，曹铭华，吴明超，毛元潮

缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)又称脑梗死，是卒中最常见的类型。缺血性脑卒中作为全球人类死亡及致残的主要原因之一，严重威胁着人类的健康和社会经济的发展。随着医学的发展，卒中治疗手段虽然取得了一定进步，但研究显示，与1990年相比，2016年全球人群卒中终身风险却从22.8%上升至24.9%，相对增加8.9%[1]。作为卒中高发国家，我国每年因卒中引发上百万人死亡，数百万患者丧失劳动力，不仅给患者家庭带来巨大打击，还给国家造成一定损失。因此卒中防治工作，任重道远。近年来机制研究发现，NO参与调节血压、血管生成以及抑制血小板聚集和白细胞粘附[2]，在卒中发病过程中具有重要保护意义，因而靶向NO治疗被给予厚望。NO的生成由一氧化氮合酶(NOS)调节，在3种NOS中，NOS3，又称内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)，因调节作用和表达分布广泛而备受关注。NOS3基因的多态性，如7号外显子G894T(rs1799983)将导致NOS3功能受损，NO产生减少[3]，参与冠心病、心肌梗死以及卒中的发生发展[4～6]。然而，关于NOS3基因多态性与脑卒中的关联知之甚少，仍需深入探索。本研究利用临床样本，旨在应用基因检测技术，探讨NOS3多态性与缺血性脑卒中的相关性，为缺血性脑卒中的一级预防以及治疗靶点提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 病例组：2017年10月-2018年9月期间在江西省景德镇市第一人民医院医院神经内科住院进行治疗的缺血性脑卒中患者100例。a.纳入标准：2017年10月-2018年9月期间在江西省景德镇市第一人民医院神经内科进行住院治疗；经头部CT或MRI检测，满足缺血性脑卒中诊断标准，且病历信息完整。b.排除标准：存在相似症状及体征疾病，如脑出血、瘤卒中、短暂性脑缺血发作和蛛网膜下腔出血，或先天残疾者如脊髓灰质炎、脑瘫患者等。对照组：同期本院所招募的健康志愿者80例，其年龄和性别比例与病例组相匹配。

1.2 血脂指标检测 受试者空腹后抽取静脉血，所有的血脂水平及载脂蛋白水平的检测工作均在江西省景德镇市第一人民医院临床检验中心完成，使用全自动生化分析仪进行血脂检测，该中心血脂测定质控合格。检测指标包括血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、以及载脂蛋白A1、B(ApoA1、ApoB)和脂蛋白a[Lp(a)]。其中，血清TC和TG的检测采用酶法，HDL-C和LDL-C采用酶联免疫一步法测定，ApoA1和ApoB及Lp(a)采用免疫透射比浊法。

1.3 DNA提取及基因型检测 采集研究对象空腹静脉血2 ml于EDTA无菌抗凝管中，混匀，-20 ℃冻存待提基因组DNA，使用传统的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。通过PCR-RFLP技术对SNPs基因型进行鉴定。引物序列：上游引物：5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3’，下游引物：5’-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3’，由Invitrogen公司合成。扩增体系为：PCR Mix(Thermo) 10 μl，引物0.1 μmol各1 μl，DNA模板25-50 ng，用ddH2O补加至20 μl。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，再在72 ℃下延伸10 min。PCR产物经Dpn Ⅱ酶切后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，其中GG等位基因因不被切割产生248 bp的一个片段，而TT等位基因可产生160 bp和88 bp的两个片段。

2 结 果

2.1 入组人群一般信息及生化指标分析 对照组与卒中组在年龄和性别上相匹配，差异均无统计学意义(P>0.05)，而在血脂水平上，脑卒中组TC、TG、HDL-C、以及ApoB、Lp(a)则显著高于对照组(P<0.05或0.01)，LDL-C、ApoA1较对照组又显著降低(P<0.01)(见表1)。表明缺血性脑卒中患者血脂水平存在异常变化。

2.2 NOS3基因rs1799983位点基因型多态性分布 3种基因型GG、GT和TT，在对照组的人数分别是64(80%)、15(18.75%)、1(1.25%)，在卒中组3种基因型人数分别是66(66%)、27(27%)、7(7%)。3种基因型分布在两组之间有显著差异(χ2=7.234，df=2，P=0.027)。等位基因G和T，在对照组的人数分别是143(89.375%)、17(10.625%)。在卒中组人数分别是159(79.5%)、41(20.5%)。两组之间有差异有统计学意义(χ2=7.17，df=2，P=0.007)(见表2)。该结果显示，NOS3基因rs1799983位点基因型多态性可能与缺血性脑卒中患病相关，T等位基因的携带，可能预示着患病风险的增加。

2.3 缺血性脑卒中患者NOS3不同基因型血脂指标 在缺血性脑卒中组中，TT基因型患者外周血中TC含量显著高于GG和GT基因型患者(P<0.01)，且GT基因型患者较GG基因型外周血TC含量也有显著升高(P<0.05)。与GG和GT基因型患者比较，LDL-C在TT基因型患者中也显著升高(P<0.01)，而在GG和GT基因型患者中无差异。但是，携带不同基因型的患者，其外周血中TG、HDL-C、ApoA1、ApoB、Lp(a)含量之间无差异(见表3)。所以在不同基因型的缺血性脑卒中患者中，血脂指标TC和LDL-C之间有显著差异，其他指标无差异。此结果表明NOS3基因多态性可能与血脂中TC和LDL-C的含量有着关联。

表1 入组人群一般信息

与对照组比较*P<0.05,#P<0.01

表2 NOS3基因rs1799983位点基因型多态性分布

注：*P<0.05,#P<0.01

表3 缺血性脑卒中患者NOS3不同基因型血脂指标

与GG组比较*P<0.05;与GG组比较#P<0.01;与GT组比较&P<0.01

2.4 NOS3基因型多态性与缺血性脑卒中发病关联分析 与NOS3的GG纯合基因型相比较，TT纯合基因携带者的卒中风险显著升高(OR=5.091，95%置信区间为1.025～25.276，P=0.047)；而GT杂合基因携带者患卒中的风险较对照组有升高趋势，但差异未达到显著性意义(见表4)。所以，NOS3基因SNP+G894T(rs1799983)与缺血性脑卒中的患病风险存在阳性关联(见表4)。

表4 NOS3基因型多态性与缺血性脑卒中发病关联分析

注：*P<0.05,#P<0.01

3 讨 论

目前研究认为NOS3功能性多态性位点有3个：T786C/rs2070744、eNOS 4a/b和G894T/rs1799983。其中，外显子G894T和内含子4a/b多态性被认为在缺血性脑卒中的发病中具有重要倾向[4]。最近的荟萃研究显示，亚洲人群的4a/b多态性的确与卒中患病相关，然而G894T在不同分类情况下，结果不一致，仍存在分歧[7]。

所以，本研究着手于NOS3的多肽位点G894T/rs1799983。研究发现NOS3基因rs1799983的多态性，与人群缺血性脑卒中的易感性相关：与GG基因型携带者相比，GT基因型换缺血性脑卒中概率有升高趋势，而TT基因型携带者的易感度更是增加了5.091倍。此外，我们还发现该基因的多态性变化，还与缺血性脑卒中患者外周血TC和LDL-C这两种血脂指标的升高存在关联。

近几年研究发现NOS3多态性位点G894T中的TT基因型相对GG基因型，可使eNOS表达下调，主要因eNOS蛋白在Caveolae(如Cav-1)上的定位改变，导致其剪切依赖反应减弱，活性发生改变，使得NO产生减少[8]。因此，研究者开始进一步深入研究eNOS的调节周期。最近研究发现，在台湾汉族人群中eNOS G894T和Cav-1 14713A/29107A的多态性与患缺血性脑卒中的危险性增加具有相关性[9]。此外，在印度人群中，研究者也发现G894T位点多态性与缺血性脑卒中具有关联[4]。上述两个研究均与本研究结果一致。

本研究首次报道eNOS G894T基因的多态性变化，还与缺血性脑卒中患者外周血TC和LDL-C这两种血脂指标的升高相关。血脂水平的升高作为动脉粥样硬化的重要危险因素，可能在一定程度上表明G894T位点的突变通过引起血脂中TC和LDL-C的升高，使得脑卒中发病危险系数增加，但其具体机制还有待进一步探索。关于血脂水平的变化，我们数据显示卒中患者血脂水平显著高于正常人，与有些研究者结果一致[10]。但也有早前研究结果报道卒中患者HDL显著降低，而TC/HDL显著升高[11]。

我们分析原因可能为：(1)所入选人群的饮食习惯具有差异，较之较早的研究，我们研究延迟十多年。在这十多年中，人们生活水平大幅提高，更加注重饮食；(2)与他人研究相比(516例缺血性脑卒中患者，131例非卒中患者)，我们的研究人群样本较小。这也是本研究的主要局限之处；(3)吴征瑜的研究对照组为与病例组同期神经内科收治的非卒中患者，来自临床患者，而我们的对照组采集的是健康志愿者血脂信息。此外，有研究发现载脂蛋白E基因的多态性可影响血脂水平，可能是缺血性脑卒中的易感因子和危险因素[12]。受限研究对象数目，本研究未能进行亚组分析，比如性别和年龄段，以及卒中危险因素抽烟、饮酒等。因此，NOS3多态性与缺血性脑卒中之间关联的确切结论，仍需后续开展多中心合作，大样本深入研究。

综上，该研究在一定程度上证明eNOS G894T突变的确与缺血性脑卒中的发生具有关联，且该位点的TT纯合突变，还引起血脂中TC和LDL-C的升高。联合其他研究，将有助于临床实践的指导，如利用遗传多态性的检测预测缺血性脑卒中易感人群，进而达到精准医疗的个体化预防和治疗的目的。