和卫温肺合剂对咳嗽变异性哮喘大鼠模型IL-4及IFN-γ的影响

曹露萍，李晓屏*，田梦影，蔡嘉洛，成 雅，廖 富

(1.湖南中医药大学，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一种容易被漏诊、误诊的特殊类型哮喘。患者的临床表现主要为未见明显的喘息、呼吸短促等症状或体征[1]。有研究表明，CVA的发病机制与哮喘有着极高的相似性，两者均为多种炎性细胞和炎性介质及细胞因子参与的慢性呼吸道炎症性疾病，其在临床上的表现为呼吸道的高反应性且气流受限具有可逆性的特征[2]。近年来有研究表明[3，4]，T辅助细胞(Th)亚群中1型和2型辅助T细胞功能失调可能是诱发哮喘发病的重要因素，而γ干扰素(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)又分别是 Th1和 Th2的细胞因子。本研究试图通过检测CVA大鼠模型血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中 IL-4及IFN-γ含量，来探索和卫温肺合剂对CVA大鼠免疫功能的调节作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只，月龄8～10周，体质量200～ 260 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(湘)2013-0006。由湖南中医药大学实验动物中心饲养，给予普通饮食及饮水。

1.1.2 试剂与药物 和卫温肺合剂主要由桂枝、芍药、生姜、炙甘草、大枣、厚朴、杏仁、党参、麦冬等药物组成，由湖南中医药大学第一附属医院治未病中心提供。其功效为调和营卫，温润肺气。

卵蛋白(美国Sigma公司产品)；10%氢氧化铝佐剂(上海化学试剂有限公司)；IL-4酶联免疫试剂盒：联科生物科技有限公司(批号：230430316)；IFN-γ酶联免疫试剂盒：联科生物科技有限公司(批号 238030316)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 除正常组10只大鼠注射生理盐水外，将上述40只SD大鼠在实验进行的第1天及第8天分别于大鼠腹部取不同部位注射新鲜配制的致敏液[5](4%卵蛋白40 μg+10%氢氧化铝100 μg，加入双蒸水1 mL中组成混合液)1 mL，从第15天起，将各准备造模的模型组大鼠每天早晨10点用1%OA溶液雾化吸入半小时，持续1周，以激发哮喘。当观测到各模型组大鼠出现腹肌明显收缩，呼吸加深、加快、打喷嚏、持续抓鼻孔等症状时，提示造模成功[6]。

1.2.2 实验分组与给药 造模成功后，将上述50只大鼠按随机分配原则平均分成5组(正常组，模型组，和卫温肺高剂量组、中剂量组、剂量组)。和卫温肺合剂低、中、高剂量组灌胃给药浓度分别为2.0、4.0、8.0 g/(kg·d)，正常组及模型组则每天用2 mL生理盐水灌胃。各组按实验剂量给药，连续给药14 d，第15天处死动物。

1.2.3 指标检测 ①血清中IL-4、IFN-γ含量检测：按酶联免疫试验试剂盒说明书，用干燥无菌管采集大鼠腹主动脉血4 mL，静置1 h后，4 ℃，2 000 r/min离心10 min，-20 ℃以下保存；②BALF中IL-4、IFN-γ含量检测：按酶联免疫试验试剂盒操作说明书操作，将各组大鼠用生理盐水行左肺支气管肺泡灌洗术，冲洗3次后，将收集的BALF共10 mL混合均匀，以1 500 r/min离心5 min，取上清液，-20 ℃保存。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血清IL-4、IFN-γ含量比较

经测定，与正常组比较，造模成功后的模型组大鼠血清中IL-4值含量明显升高，而IFN-γ值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示CVA的发病与IL-4、IFN-γ含量具有密切关系；相较于模型组，经和卫温肺合剂治疗后的各组大鼠的IL-4含量明显降低，IFN-γ值明显升高(P<0．05)，提示各组对CVA的治疗均起到了一定作用，其中高剂量组疗效最显著，高剂量组大鼠血清IL-4及IFN-γ含量与低、中剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，各治疗组血清IL-4及IFN-γ的含量相较于正常组，差异亦有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

组别IL-4IFN-γ正常对照组14.80±1.13241.76±15.08模型组65.89±4.17*43.47±4.13*合剂低剂量组60.36±4.65*53.10±5.98*合剂中剂量组55.27±3.54*#△63.71±6.13*合剂高剂量组50.01±3.17*#△▲79.45±5.25*#△▲

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与合剂低剂量组比较，ΔP<0.05；与合剂中剂量比较，▲P<0.05。

2.2 各组大鼠 BALF中IL-4、IFN-γ含量比较

与对照组相比，模型组大鼠BALF中IL-4含量明显升高，IFN-γ含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示CVA发病与IL-4、IFN-γ含量有密切关系；经治疗后，与模型组比较，各组大鼠的IL-4含量均有不同程度降低，IFN-γ值均有不同程度升高(P<0．05)，合剂高剂量组指标改善情况最为显著，说明合剂高剂量组对BALF中IL-4、IFN-γ含量的调节作用优于其他各组。见表2。

组别IL-4IFN-γ正常对照组11.80±0.67468.76± 34.08模型组25.89±0.85*163.47±24.13*合剂低剂量组24.36±0.95*183.10±25.98*合剂中剂量组15.27±0.54*#△313.71±26.13*合剂高剂量组14.01±0.87*#△▲397.45± 25.25*#△▲

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与合剂低剂量组比较，ΔP<0.05；与合剂中剂量组比较，▲P<0.05。

3 讨论

咳嗽变异型哮喘的发病机理与Th细胞有密切关系，而Th细胞又有Th1亚群和Th2亚群。现代研究表明，Th1分泌的IFN-γ细胞因子减少，而Th2分泌的IL-4、IL-5、IIL-13细胞因子增多是哮喘发病的关键机制，Th1/Th2失衡可能是支气管哮喘发病的一个重要环节，或始动因素[7]。在Th1、Th2分泌的细胞因子中，IL-4和IFN-γ是一对作用机制相反的细胞因子，在哮喘发病中起到重要作用。

中医对哮喘的研究由来已久，《伤寒论》中已有“太阳病，下之微喘者，表未解故也，桂枝加厚朴杏子汤主之”及“喘家，作桂枝汤，加厚朴、杏子佳”的记载，可见，古代医家已有应用桂枝加厚朴杏子汤治疗哮喘的先例。本研究所用合剂由桂枝汤加厚朴、杏子、党参、麦冬等组成，方中桂枝合生姜共奏发汗解表化湿之功，以解除卫分邪气；桂枝合白芍以调和营卫；甘草、大枣扶助正气、补益生化之源[8]；党参、麦冬益气润肺；厚朴行气消痰除满；杏仁入肺以止咳平喘，全方共奏解肌祛表、益气扶正、行气止咳平喘之效。根据现代研究[9，10]，桂枝汤在调和营卫，提高人体免疫机能及止痛镇静方面具有良好作用；而厚朴不仅具有广泛的抗菌作用，还能使支气管平滑肌舒张并能麻痹运动神经末梢，从而达到松弛肌肉的目的；杏仁中含有的氢氰酸能镇静呼吸中枢，小剂量便可平静呼吸起到止咳平喘的作用。

本实验研究结果表明，和卫温肺合剂通过调节CVA模型大鼠血清及BALF中IFN-γ和IL-4含量，从而发挥治疗CVA的作用，就疗效来说优于其他对照组。与模型组相比，各治疗组均可不同程度降低大鼠血清及BALF中IL-4含量并提高IFN-γ含量，说明和卫温肺合剂可降低机体血清及BALF中IL-4水平，提高IFN-γ含量，以调控 Th1/Th2水平，达到缓解临床症状、控制哮喘的目的。由于中药复方作用的复杂性，虽然本实验研究结果表明和卫温肺合剂可调控 Th1/Th2水平，但更深层次的调节机制尚不完全明确，仍待进一步研究。