结核感染T淋巴细胞实验和Xpert MTB/RIF检测在糖尿病并发菌阴性肺结核患者诊断中的价值*

周 祎,张 宁,刘晓荣,刘 莉

陕西省结核病防治院内五科(西安 710100)

结核病仍是威胁人类健康的主要公共卫生和社会问题[1]。糖尿病患者是目前临床常见病及多发病，也是结核病的危险因素之一[2]。另外糖尿病病理过程也会影响抗结核药物的治疗效果及结核病的预后[3-4]。因此早诊断、早治疗对结核病并发糖尿病的预后尤为重要。目前肺结核的诊断主要依赖于临床症状、胸部X线特征和痰细菌学检查等，细菌学检测为结核诊断提供了确切依据，但痰菌检测易受多种因素影响，据报道约60%的肺结核患者痰涂片表现为抗酸杆菌阴性，从而对部分患者造成漏诊或误诊[5]。结核感染T淋巴细胞实验(T-SPOT.TB)是一种新型的免疫酶技术，能够在细胞水平进行结核杆菌的检测。Gen-XpertMTB/RIF试验是WHO推荐用于检测结核病的分子诊断平台，是以半巢式实时荧光PCR技术为基础，可在2.5 h内检出TB和利福平的耐药性，且该方法操作简便，对实验环境要求不高，明显缩短了所有可疑结核患者检测时间。但是目前T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF检测对糖尿病并发菌阴性肺结核患者诊断中的应用价值尚不明确。本研究通过对糖尿病并发菌阳性和菌阴性肺结核患者血液和痰液标本进行结核抗体(TB-AB)，T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF检测，比较和评价T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF检测对糖尿病并发菌阴性肺结核患者的诊断价值。

资料与方法

1 一般资料 选取2015年7月至2017年8月陕西省结核病防治院收治的糖尿病并发肺结核患者共285例，其中菌阳肺结核并发糖尿病患者111(42.20%)例，均通过细菌学和临床诊断确诊；菌阴性肺结核并发糖尿病患者152 (57.80%)例，均通过临床和辅助诊断确诊。排除病例22例，其中肺炎12例，非结核分枝杆菌肺病4例，肺部肿瘤6例。263例患者同时行结核抗体、T-SPOT检测和Gen-XpertMTB/RIF 检测,其中男217例，女46例；年龄15～83岁，平均年龄(53.60±13.44)岁。根据诊断结果：①菌阳组肺结核并发糖尿病患者 111例，男91例，女20例 ；年龄16～80岁，平均年龄(53.58±13.22)岁；②菌阴组肺结核并发糖尿病152 例，男126例，女26例；年龄15～83岁，平均年龄(53.62±13.65)岁。肺结核诊断符合国家卫计委发布的《新版肺结核的分类及诊断标准(2018年版)》[6]。糖尿病诊断符合2012年美国糖尿病学会(ADA)糖尿病诊疗指南中的糖尿病诊断标准[7]。

2 检测方法

2.1 血清结核抗体(TB-AB)检测：采集住院患者的晨起静脉血4 ml于带凝胶的红帽血清管中，标本按常规法分离、储存。严格按照MTB IgG和IgM抗体检测试剂盒(蛋白抗体)使用说明书(南京大渊生物技术工程有限责任公司)进行操作，采用蛋白芯片法分别检测菌阳组和菌阴组肺结核并发糖尿病患者血清16kD和38kD及LAM蛋白抗体；采用胶体金法检测血清MTB-IgG和MTB-IgM抗体。结果按说明书判断：上述5种任一抗体结果阳性即判为检测阳性，血清5种抗体全部阴性判为检测阴性。蛋白芯片法和胶体金法检测肺结核患者血清抗结核抗体操作简便，不需要特殊仪器，耗时少，前者约10～30 min，后者约10 min内完成。

2.2 T-SPOT.TB检测：用肝素抗凝管抽取静脉血4～6 ml，无需空腹，轻柔颠倒混匀5-10次，避免溶血及凝结；做好患者标识，直立放置于室温(15～25℃)，不得冷冻和冷藏。实验操作严格按照T-SPOT.TB试剂盒(美国Oxford immuno-tec公司)说明书进行。首先进行外周血单个核细胞分离制备，其次对单个核细胞进行洗涤和计数，然后制备工作浓度细胞悬液，再将细胞悬液和抗原加入微孔培养板，置于37℃，于5% CO2培养箱中孵育过夜，洗涤微孔板并加入酶标抗体，再洗涤微孔板，加入底物反应液，最后进行斑点计数。根据抗原A和(或)抗原B孔的反应判断结果：阴性对照孔斑点数为0-5，阳性样本应为：抗原A或抗原B斑点数-阴性对照孔斑点数≥6；当对照孔斑点数≥6，阳性样本应为：抗原A或抗原B斑点数≥2×阴性对照孔斑点数。

2.3 Gen-XpertMTB/RIF检测:收集肺结核并发糖尿病患者的即时痰液标本于痰瓶中，拧紧瓶盖，痰样本保存于2～8℃，及时送检。Gen-XpertMTB/RIF检测系统及试剂盒由美国Cepheid公司生产。按照仪器、试剂操作要求对标本进行处理后，取2 ml加入反应盒，将反应盒放入检测模块仪器进行检测，反应结束后，在检测系统窗口下直接观察测试结果，系统报告为错误、无效的结果不纳入结果统计中。

3 观察指标 ①以肺结核临床诊断为金标准，比较TB-AB、T-SPOT.TB检测和Gen-Xpert MTB/RIF检测3种方法检测糖尿病并发肺结核的阳性率之间的差异；②比较TB-AB、T-SPOT.TB检测和Gen-Xpert MTB/RIF检测3种方法在菌阳组、菌阴组之间的差异；③比较菌阴组不同性别和年龄段患者三种方法检出阳性率的差异；④检测各种检测方法联合应用诊断阳性率的变化。

4 统计学方法 使用SPSS 22.0统计学软件进行统计学处理，TB-AB、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF检测阳性率之间差异的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 三种检测方法在肺结核并发糖尿病患者中阳性率的比较 263例临床诊断为糖尿病并发肺结核患者中TB-AB检出阳性163例，阳性率为61.98%；T-SPOT.TB检出阳性222例，阳性率为84.41%；Gen-XpertMTB/RIF检出阳性188例，阳性率为71.48%。三种检测方法之间的阳性率相比，差异具有统计学意义(χ2=33.544，P=0.000)。T-SPOT.TB阳性率与TB-AB阳性率比较差异有统计学意义(χ2=33.730，P=0.000)；Gen-XpertMTB/RIF检出阳性率与TB-AB检测阳性率比较差异有统计学意义(χ2=5.325，P=0.021)；T-SPOT.TB阳性率与Gen-XpertMTB/RIF阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=12.785，P=0.000)

2 三种检测方法在糖尿病并发肺结核菌阳组、菌阴组患者阳性率的比较 111例糖尿病并发菌阳肺结核患者中，TB-AB阳性率为64.86%(72/11)；T-SPOT.TB检出阳性率为89.19%(99/111)；Gen-XpertMTB/RIF阳性率为77.47%(86/111)。152例糖尿病并发菌阴肺结核患者中，TB-AB阳性率为59.87%(72/152)，T- SPOT.TB阳性率为80.92%(123/152)，Gen-XpertMTB/RIF阳性率为67.11%(102/152)。卡方检验显示：菌阳组和菌阴组之间三种方法检测阳性率比较差异均无统计学意义(P=0.068，P=0.410和P=0.066)。

3 不同年龄和性别糖尿病并发菌阴肺结核患者中三种检测方法阳性率的差异 我们比较了三种结核检测方法对不同年龄和性别糖尿病并发菌阴肺结核患者中阳性率的差异，结果如表1所示：三种方法在男性患者和女性患者中的检出阳性率相当，比较差异均无统计学意义。此外，根据年龄分层后，在不同年龄患者三种检测方法的阳性率比较差异无统计学意义，而在相同年龄段的患者中，T-SPOT.TB阳性率较高，Gen-XpertMTB/RIF次之，结核抗体阳性率较低。

表1不同年龄和性别糖尿病并发菌阴肺结核患者中三种检测阳性率的比较[例(%)]

4 结核抗体、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF联合应用检出阳性率比较 我们进一步分析了三种方法联合应用对结核检出阳性率的影响，结果如表2所示：2种方法或3种方法联合使用，检出率均有所提高。T-SPOT.TB与结核抗体或Gen-XpertMTB/RIF联用，菌阴组TB阳性率均达到90%以上，而三种联用时菌阴组检测阳性率则达到94.73%。三种方法单独使用或联合应用，其阳性率在菌阴组和菌阳组之间均无统计学差异。

表2TB-AB、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF联合诊断阳性率比较[例(%)]

讨 论

2017年WHO全球结核病报告指出，2016年全球新发结核病1040万例，中国新发结核病患者89.5万例，因此，结核病仍是威胁人类健康的主要公共卫生和社会问题[1]。2015年全球糖尿病患病率达到8.8%，即估计全球共有4.15亿糖尿病患者，其中75%来自低收入国家.中国是世界上糖尿病患者最多的国家，糖尿病患者是结核病的高危人群。据报道，我国肺结核患者中有超过10%患有糖尿病，糖尿病人新发肺结核是正常人的3倍[8]。糖尿病患者血糖持续高水平可引起机体代谢紊乱，导致免疫力低下，且高血糖为结核菌繁殖提供良好培养基，从而增加易感性；血糖过高可造成机体内环境呈酸性，有利于结核菌的生长及繁殖；另外糖尿病可累及肺部，导致微血管病变和气道黏膜受损，有利于结核菌的繁殖。另外，与单纯TB患者相比，合并糖尿病患者表现出更高的分枝杆菌载量、肺部空洞比例、更高的耐药性以及更高的复发率和病死率。因此，糖尿病患者的不断增加对全球结核病的控制造成威胁。早发现、早诊断、早治疗糖尿病并发肺结核患者，对控制两病共流行的疫情意义重大。但目前结核病病原学诊断率低，2017年全球结核病报告指出，我国登记的肺结核患者中，细菌学阳性率仅为31%[9]，难以满足临床诊断的需求，结核分枝杆菌培养虽是结核病诊断的金标准，但其生长缓慢耗时，不适合结核病的早期诊断[10]。结核病血清免疫诊断的临床应用研究逐渐成为全球结核领域的热点，在临床广泛应用，但存在假阳性及假阴性的问题，从而影响着临床诊断[10]。

近年的研究发现，结核分枝杆菌RD1区编码一些结核分枝杆菌特异性复合抗原，如ESAT-6和CFP-10，它们是重要的T淋巴细胞抗原，可以被结核杆菌感染的免疫活性T淋巴细胞识别，产生高水平的IFN-γ[11]。T-SPOT.TB是由酶联免疫斑点技术发展而来，通过以ESAT-6和CFP-10刺激外周血单核细胞中的结核特异性T细胞分泌IFN-γ与否来判定是否感染结核，其敏感性和特异性可达到83%～97%[12-13]。但它不能鉴别活动性结核病和潜伏感染而不推荐用于活动性结核病的诊断[14-15]。杨宜英等[16]报道，T-SPOT.TB在菌阳和菌阴结核中的阳性率分别为95.5%和85.9%。刘佳庆等[17]的研究中，T-SPOT.TB在菌阴结核中的阳性率为83.7%。本研究中糖尿病并发菌阴肺结核患者中T-SPOT.TB阳性率为80.92%，与前述研究结果接近，表明T-SPOT.TB在糖尿病患者中也具有临床应用价值。

Gen-XpertMTB/RIF试验是WHO推荐用于检测结核病的分子诊断平台，是以半巢式实时荧光PCR技术为基础，rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)的81bp核心区为靶序列，可在2.5 h内检出MTB和利福平的耐药性，且该方法操作简便，对实验环境要求不高，明显缩短了可疑结核患者检测所需时间[18-20]。部分研究表明，随着分子生物学技术进入结核病领域，先进的分子生物学检测技术可以明显提高病原学阳性率。但其成本高，不适合在基层单位广泛开展。Gen-XpertMTB/RIF近年发展迅速，与传统检测方法比较，敏感度和特异度均明显升高[21-22]。目前，关于Gene-Xpert MTB/RIF在菌阴性肺结核中的检测阳性率的报道也存在较大差异。陈子芳等[23]作者的研究显示：126例菌阴性结核患者中 Gene-Xpert MTB/RIF痰检阳性患者49例，阳性率仅为38.89%，而支气管肺泡灌洗液检测阳性率为53.17%。蔡向敬等[24]最近的报道中，317例菌阴性结核患者Gene-Xpert MTB/RIF法的检出率为61.40%。本文中Gene-Xpert MTB/RIF的检出率为67.11%，与后者较接近。我们也发现在菌阴组Gene-Xpert MTB/RIF的检出率显著低于T-SPOT.TB，这可能是由于菌阴组患者痰液样本中的菌含量较低，甚至可能低于Gene-Xpert MTB/RIF的检出限，使其阳性率低于T-SPOT.TB对血液样本中的检出率。此外，Gene-Xpert MTB/RIF与T-SPOT.TB联用后，菌阴性结核的阳性率达到92%，检出率较大幅度升高，更有助于快速诊断。

综上，在糖尿病并发菌阴肺结核患者中，T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF方法诊断效率高于传统的结核抗体检测，从而有助于糖尿病并发菌阴肺结核的快速诊断，但是其诊断效能仍需更多的临床样本予以证实。