加巴喷丁对感染后咳嗽大鼠肺组织瞬时受体电位香草酸亚型1、P 物质、降钙素基因相关肽的影响研究*

李天浩，王惠琴，高小娟，胡 晨，任加良

陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712000)

感染后咳嗽(Post-infectious cough，PIC)是指感冒急性期过后，仍咳嗽不止，多持续3～8周[1]。目前认为，PIC是由于咳嗽敏感性增高所致，而气道神经源性炎症则是导致咳嗽敏感性增高的重要因素之一[2]。研究发现，加巴喷丁能显著改善慢性咳嗽患者症状，咳嗽频率及咳嗽严重程度均较安慰剂组显著下降[3-4]，但其治疗慢性咳嗽的作用机制尚不清楚。本研究通过加巴喷丁对PIC大鼠肺泡灌洗液(Bronchoalverlar alveolar lavage fluid，BALF)和肺组织瞬时受体电位香草酸亚型1(Transient receptor potential vanilloid subtype 1，TRPV1)、P 物质(P substance ，SP)及降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)的影响，探讨加巴喷丁对PIC气道神经源性炎症的干预作用机制。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物:清洁级、雄性SD大鼠60只，180～240 g，购于西安交通大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(陕)2012-003。实验大鼠分笼饲养，自由饮水进食，适应性喂养3～7 d。本研究符合陕西中医药大学实验动物伦理委员会相关要求并审批通过。

1.2 实验试剂：加巴喷丁胶囊：国药准字号：H20040527，规格：0.1×48粒。辣椒素购于合肥四峰生物科技有限公司。LPS、SP、CGRP ELISA试剂盒均购于美国Sigma公司。TRPV1试剂盒购于英国Abcam公司。

2 研究方法

2.1 实验分组及模型建立：将大鼠随机分为正常组、模型组、西药组，每组20只，参照文献[5-6]方法建立PIC模型。将实验大鼠置于1m3的特制的烟室中，每日用锯末50 g、香烟10支，点燃进行烟熏，每日烟熏40 min，1次/d。连续10 d，大鼠每日自由进食、饮水，分别于第13天、16天、19天，用10%水合氯醛经腹腔内注射将大鼠麻醉，然后经鼻腔滴入浓度为0.4 mg/ml的LPS液，分别于第14天、15天和第17天、18天以及第20天，将大鼠置于特制的诱喘容器中，用10-4mol/L的辣椒素溶液雾化吸入，每次雾化吸入3 min，1次/d。

2.2 给药方法：各组大鼠于试验第14天起开始灌胃给药，连续10 d。正常组、模型组均给药0.9%氯化钠注射液10 ml/kg灌胃给药，1次/d，西药组给予加巴喷丁(胶囊3粒0.3 g去壳，将药粉溶于0.9%氯化钠注射液300 ml，配制成1 mg/ml)，5 ml/kg灌胃给药，1次/d。

2.3 指标检测:① 结束给药后，观察每组大鼠的咳嗽次数，观察3 min并记录。② 肺泡灌洗液(BALF)中TRPV1、SP、CGRP含量测定: 将大鼠麻醉后迅速开胸，并结扎右主支气管，同时经左主支气管向左肺内缓慢注入0.9%氯化钠注射液4 ml，保留10 s，回抽后再次缓慢注入，重复3次。收集BALF后经低温3000 r/min离心10 min后，取上清液置于-80度冰箱保存备用。严格按试剂盒说明进行ELISA检测。③ 肺组织病理标本制备:在向左主支气管灌注同时，迅速取下右肺，并用10%多聚甲醛液固定后，取材石蜡包埋、切片，行HE染色，观察肺组织病理学变化。④ 免疫组化法检测肺组织TRPV1、SP、CGRP蛋白表达 : 肺组织石蜡切片脱蜡、水合，3%过氧化氢室温孵育10 min，抗原修复，室温封闭30 min，一抗 4℃过夜，HRP 标记免疫组化二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木素、伊红复染。免疫组化图片结果采用 Leica 显微镜进行观察、拍照，比较蛋白表达强度(灰度)，行半定量分析。

结 果

1 各组大鼠咳嗽次数比较 模型组大鼠咳嗽次数明显增多，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；经西药干预后，大鼠咳嗽次数明显减少，与模型组比较，差异有统计学义(P<0.05)。见表1。

表1大鼠3min咳嗽次数比较

注：与模型组比较，*P<0.05

2 各组大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP测定比较 正常组大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP均轻度表达，模型组以上各指标均明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)； 经西药干预后，西药组大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP表达均减低，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 各组大鼠肺组织病理学变化 光镜下，正常组(图1A)支气管黏膜无水肿，可见少量炎性细胞浸润。模型组(图1B)支气管黏膜水肿，上皮脱落，肺泡壁轻度水肿，上皮变性、坏死、脱落，间质充血、水肿，可见大量炎性细胞浸润。西药组(图1C)病理改变类似模型组，但总体炎性改变较模型组轻。

表2各组大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP含量比较(ng/L)

注：与模型组比较，*P<0.05，△P<0.05

图1 大鼠肺组织病理学(HE染色)

4 各组大鼠肺组织TRPV1、SP、CGRP免疫组化检测结果 见表3。与正常组比较，模型组、西药组大鼠肺组织TRPV1、SP、CGRP蛋白均升高(P<0.05)；与模型组比较，西药组大鼠肺组织TRPV1、SP、CGRP蛋白表达减低(P<0.05)。

表3各组大鼠肺组织TRPV1、SP、CGRP比较(灰度值)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

讨 论

咳嗽是临床常见病症，程度有轻有重，严重者影响人们的学习、工作和生活。临床上依据咳嗽持续时间，将咳嗽分为3类：急性咳嗽，是指咳嗽持续时间小于3周，慢性咳嗽，是指咳嗽持续时间大于8周，介于3～8周者称之为亚急性咳嗽，PIC即属于此类咳嗽范畴。

PIC是由于咳嗽敏感性增高所致，但其发病机制未完全阐明，目前认为与瞬时受体电位(TRP)通路激活、气道炎症、气道神经源性炎症关系密切[7]。TRPV1位于哺乳动物C类神经纤维，广泛分布于中枢神经系统、肝、肺、支气管、皮肤等组织器官，是机体一种重要的伤害性感受分子，可对多种有害刺激做出反应[8]。TRPV1是首个被证实能够介导豚鼠咳嗽反射的TRP通道[9]，能上调咳嗽敏感性，其数量与咳嗽反应强度正相关[10]。当呼吸道感染病毒后，BALF中前列腺素E2(PGE2)的合成明显增加，并与EP受体结合，通过与EP受体藕连的G蛋白转导信号，经过 CAMP/PKA 机制激活和敏化TRPV1 通道[11]。激活的TRPV1可引起大量Ca2+内流，导致神经末梢释放神经肽增多，包括SP、CGRP等。SP和其受体广泛分布于呼吸道，包括气道上皮、腺体、平滑肌[12]。当气道受到感染、烟雾等刺激后，SP释放增多，再次刺激C纤维，释放更多的神经肽，刺激气道咳嗽感受器引起咳嗽[13-14]。CGRP也是主要的神经源性介质之一，位于气道上皮C类神经纤维，当气道受到理化刺激后，其合成与释放也增多，引起咳嗽反射[15]。这些炎症介质相互作用，导致咳嗽敏感性增加。因此，PIC的主要特征是咳嗽敏感性增高并伴有SP、CGRP 增高为特点的气道神经源性炎症。这些气道神经源性炎症主要是通过肺内一种称之为中性内切酶(Neutral endopeptidase,NEP)来降解，从而使这些介质的产生与释放处于动态平衡，调节咳嗽敏感性。

多目前为止，PIC尚缺乏有效的治疗药物。加巴喷丁是神经递质γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂，常用于带状疱疹后疼痛、糖尿病外周神经痛及复杂局部疼痛综合征的治疗。近年来研究发现，加巴喷丁用于慢性咳嗽治疗，也取得了良好的疗效，且患者对其副作用也可较好的耐受，但对其作用机制尚不明确。

本研究表明，与模型组相比，加巴喷丁能有效减少大鼠咳嗽次数，降低大鼠BALF中TRPV1、SP、CGRP含量，减轻大鼠肺组织炎症反应。因此，我们推测，加巴喷丁可能是通过干预TRPV1、SP、CGRP来降低PIC气道神经源性炎症，从而达到治疗PIC。