促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤的抑制作用
2019-09-04赵德福张辉杨文海
赵德福 张辉 杨文海
(锦州医科大学附属第三医院神经内科,辽宁 锦州 121000)
我国脑血管病的发病率和死亡率都位居第一位,而脑血管病患者中约70%为缺血性脑血管病,后者主要的一个病理损伤就是缺血再灌注损伤〔1〕。在缺血再灌注损伤这一病理过程中,有多种发病机制参与其中,如细胞外基质的破坏、钙超载、炎症反应〔2〕等,这其中起到重要作用的是细胞外基质的破坏〔3〕。据报道有细胞外基质破坏作用的物质之一就是基质金属蛋白酶(MMP)-9〔4〕,而转化生长因子(TGF)-β1能起到修复组织损伤的功能〔5〕。本实验,拟在脑缺血再灌注模型大鼠中以促红细胞生成素(EPO)为干预手段,以TGF-β1和MMP-9为实验观测指标,探索EPO在脑缺血再灌注模型大鼠细胞外基质损伤与修复过程中的保护作用。
1 材料与方法
1.1仪器 160x连续变倍体式显微镜(桂林仪器厂);CIAS-1000图像分析仪(北京大恒图像视觉有限公司);LEICA-RM2135石蜡切片机(德国莱卡公司)。
1.2试药 EPO(成都地奥制药厂);TGF-β1一抗及MMP-9一抗(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.3动物 由锦州医科大学实验动物中心提供,90只健康SD大鼠,雄性,大鼠体重240~260 g,许可证号:SCXK(辽)2003-2007。
1.4大鼠分组与给药 大鼠被随机分为5组(每组18只):假手术组、缺血再灌注组和EPO低、中、高剂量(1 000 U/kg、3 000 U/kg、5 000 U/kg,中剂量EPO取人临床应用剂量标准)组,术前EPO 3个剂量组分别给予规定剂量的EPO腹腔注射连续3 d,每天1次,在相同条件下,缺血再灌注组和假手术组分别给予腹腔注射等量的生理盐水。
1.5模型制备方法 大鼠大脑中动脉闭塞模型采用线栓法〔6〕。所有大鼠术前禁食禁水6 h,腹腔注射水合氯醛(浓度为3 ml/kg)麻醉,固定于手术台,颈中略偏左切开皮肤,找到颈总动脉并手术分离,从其近心端用颈动脉夹夹住,手术剪于颈总动脉剪一切口,动脉插管插入,顺动脉导管插入已处理的鱼线,经颈总动脉、颈内动脉到大脑中动脉,以充分阻断大脑中动脉的血流,然后插管撤出,皮肤缝合,鱼线于血流中断2 h撤出,血流再灌注,持续时间12 h,判定缺血再灌注模型制备成功的标准为神经功能评分〔6〕为1~3分。
1.62,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察各组大鼠脑梗死体积 上述处理后,每组抽取大鼠6只,断头处死后留取脑组织,并将脑组织置于温度为-20℃的冰箱中持续20 min,沿脑组织的冠状面将其制成厚度为0.2 mm的脑片,将其浸入到浓度为2% 的TTC溶液,温度为37℃的水浴持续30 min。将采集来的图像,应用图像处理软件做相应处理,脑梗死体积计算方式采用文献〔7〕的方法计算。
1.7免疫组化法观察TGF-β1、MMP-9的表达 每组取6只大鼠,乌拉坦(5 ml/kg)麻醉,断头后分离海马组织,多聚甲醛(浓度4%)固定,制备厚度约5 μm的切片,切片予脱蜡、洗涤,过氧化氢(H2O2,浓度3%)处理,用浓度为0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,每次5 min,滴加TGF-β1或MMP-9一抗,孵育过夜(温度控制4℃),PBS洗涤3次,每次5 min,予滴加二抗,37℃孵育30 min,室温孵育10 min,PBS洗涤3次,每次5 min,滴加二氨基联苯胺显色,苏木素复染,酒精脱水,二甲苯透明,干燥,镜下观察。
1.8Western印迹检测TGF-β1、MMP-9蛋白的表达 取剩余6只大鼠,麻醉断头取海马组织,剪碎,加入裂解液,离心机离心,留取上清液,制备组织蛋白样品;测定蛋白含量;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓度10%);将组织蛋白转移至正电荷尼龙膜上;封闭杂交;试剂盒显色;分别分析TGF-β1蛋白和MMP-9蛋白的表达量。
1.9统计学方法 应用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、t检验。
2 结 果
2.1神经功能缺损评分 假手术组神经功能正常;缺血再灌注组与假手术组相比,出现明显的神经功能障碍,评分升高(P<0.01);EPO 3个剂量组神经功能与缺血再灌注组相比,评分明显降低(P<0.01);与EPO低剂量组相比,EPO中、高剂量组神经功能障碍程度显著减轻,评分显著下降(P<0.05);而EPO中剂量组神经功能与EPO高剂量组相比无显著差异(P>0.05)。见表1。
2.2TTC染色结果 假手术组脑组织颜色红润,无梗死;缺血再灌注组和EPO 3个剂量组梗死区脑组织肿胀,颜色苍白,进一步计算脑梗死体积,发现缺血再灌注组显著高于EPO 3个剂量组(P<0.01);与EPO低剂量组比较,EPO中、高剂量组脑梗死体积进一步减小(P<0.05);但EPO中剂量组与EPO高剂量组间无显著差异(P>0.05)。见表1。
表1 各组神经功能学评分及脑梗死体积比较
与假手术组比较:1)P<0.01;与缺血再灌注组比较:2)P<0.01;与EPO低剂量组比较:3)P<0.05;下表同
2.3免疫组化染色结果 观察大鼠海马组织CA1区,正常时MMP-9和TGF-β1主要存在于细胞胞质内,蛋白表达量少,被外界刺激因素激活后TGF-β1迅速从胞质转移至细胞核。TGF-β1、MMP-9在假手术组细胞内极少表达。缺血再灌注组胞核内TGF-β1及胞质内MMP-9较假手术组表达明显增多(P<0.01)。与缺血再灌注组相比,EPO 3个剂量组胞核内TGF-β1表达明显增多,胞质内MMP-9的表达明显减少(P<0.01),且EPO中、高剂量组TGF-β1、MMP-9的变化较EPO低剂量组更明显(P<0.05)。但EPO中、高剂量组间TGF-β1、MMP-9的表达无明显差异(P>0.05)。见图1,表2。
图1 各组TGF-β1、MMP-9免疫组化染色结果(×400)
表2 免疫组化检测各组大鼠TGF-β1 和MMP-9的表达
2.4Western印迹法检测结果 TGF-β1和MMP-9蛋白在假手术组大鼠海马区几乎不表达。与假手术组相比,缺血再灌注组TGF-β1、MMP-9的蛋白表达明显升高(P<0.01)。与缺血再灌注组相比,EPO 3个剂量组TGF-β1表达明显增多,MPP-9的表达明显降低(P<0.01),与EPO低剂量组相比,EPO中、高剂量组TGF-β1和MPP-9表达量变化更加显著(P<0.05);EPO中、高剂量组间TGF-β1和MMP-9的表达无明显差异(P>0.05)。见表3。
表3 Western印迹检测各组TGF-β1 和MMP-9蛋白表达
3 讨 论
脑缺血再灌注损伤是脑梗死发病及治疗过程中的一个非常重要的病理生理过程〔8〕。脑梗死后缺血再灌注损伤的病理机制多种多样,细胞外基质的破坏在此过程中扮演了重要角色。
降解细胞外基质的重要物质之一是MMP-9,MMP-9在正常脑组织细胞很少表达,当脑缺血再灌注时,脑组织细胞内MMP-9〔9〕表达明显增多,MMP-9将会降解Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等细胞基底膜的成分,结果是脑内血管通透性增加,脑血脑屏障受到破坏。与MMP-9破坏细胞外基质功能相对应的是,TGF-β1具有组织损伤修复的功能〔10〕。TGF-β1的存在曾被看作是神经元存活的重要标志,其具有多种生理功能,包括促进细胞生长分化、抑制炎症及促进组织修复等。TGF-β1在脑缺血过程中的作用近年来被逐渐重视〔11〕,脑损伤时TGF-β1的表达对脑损伤的保护和修复极其关键〔12〕。
EPO是临床中各种贫血治疗中的一线用药。其在神经保护方面的作用是近年来国内外研究的热点,结果不一,Jantzie等〔13〕的研究发现 EPO对脑损伤具有修复作用,也有研究发现EPO具有广泛的神经保护功〔14〕,但其发挥作用的具体机制目前尚不十分明确。
本实验结果显示,缺血再灌注组在缺血再灌注12 h后较假手术组神经功能障碍明显,脑梗死体积增大,海马组织TGF-β1及MMP-9的表达升高;EPO各剂量组与缺血再灌注组比较,大鼠神经功能缺损减轻,脑梗死体积减小,海马区TGF-β1的表达增加,MMP-9的表达下降,这一实验结果提示,大鼠脑缺血再灌注损伤的过程中MMP-9发挥了重要作用,而 在这一过程中,TGF-β1对脑损害起到保护功能。实验还表明,脑缺血再灌注过程中,EPO可以使MMP-9的表达减少,TGF-β1的表达增多,起到神经保护作用。EPO的剂量不同,其发挥作用的程度也不同,与EPO低剂量组相比,EPO中、高剂量组效果更明显,EPO中、高剂量组间效果无明显差异。在效果相同的情况下,EPO作为促进红细胞生成药物,高剂量组其副作用可能也会较大,因此,中剂量EPO其发挥脑保护作用可能最佳。