两种体外培养星形胶质细胞的比较

沈 慧，许 琪

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

星形胶质细胞构成哺乳动物中枢神经系统中约40%的细胞，对维持神经系统稳态至关重要[1]。体内的星形胶质细胞具有静息态和反应态两种细胞亚型，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的上调代表着反应态星形胶质细胞的增加[1]。星形胶质细胞的培养模式主要有原代星形胶质细胞培养[2]、直接分离培养体内成熟的星形胶质细胞[3]和神经干细胞分化[4]3种方式，其中又以第1种方法的使用范围最广。有研究表明原代星形胶质细胞可能作为一种反应态星形胶质细胞，而体内星形胶质细胞分离培养耗材费力且繁琐复杂，不适合大量培养实验[5]。因此，本研究将目标放在第3种星形胶质细胞—神经干细胞诱导分化的星形胶质细胞，并比较其与原代星形胶质细胞的差异。

材料和方法

材料 小鼠原代星形胶质细胞；小鼠原代神经干细胞；DMEM培养基(MACGENE公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(BI公司)；青霉素-链霉素溶液(MACGENE公司)；神经基底培养基(Thermo公司)；B27人工血清(Thermo公司)；谷氨酰胺(MACGENE公司)；鼠源表皮生长因子(PeproTech公司)；重组鼠碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech公司)；重组人白介素(interleukin，IL)-1α(PeproTech公司)；重组人IL-1β(PeproTech公司)；重组人IL-6(PeproTech公司)；重组人IL-12(PeproTech公司)；重组人IL-18(PeproTech公司)；重组人肿瘤坏死因子-α(PeproTech公司)；重组人干扰素α(interferon-α，IFN-α)(PeproTech公司)；重组人IFN-γ(PeproTech公司)；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(PeproTech公司)；重组人转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(PeproTech公司)；GFAP(GA5)鼠源单克隆抗体(CST公司)；抗小鼠 594 nm抗体(Thermo公司)；左旋多聚赖氨酸溶液(Sigma公司)；干细胞分离液(Thermo公司)；细胞裂解液(Sigma公司)。

小鼠原代星形胶质细胞培养并鉴定 取出生1 d乳鼠的大脑，用手术镊去除小脑、嗅球、海马以及表面的血管，留下皮层，1 ml枪头和5 ml注射器先后反复吹打机械破碎组织块，800 r/min(转子半径12.72 cm)离心3 min后重悬铺于多聚赖氨酸(浓度0.02 mg/ml液体覆盖过培养皿底)包被液包被过的细胞培养皿上，10% FBS-DMEM(FBS浓度10%，双抗1%)培养基培养2～3 d后吹下附着在星形胶质细胞上的细胞碎片，进一步培养至细胞全部长满整个培养皿。甲醛固定，5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭，GFAP孵育过夜，抗小鼠二抗 594 nm室温孵育，显微镜下观察分化情况。根据GFAP免疫荧光染色，原代星形胶质细胞的阳性细胞比例大于90%。

小鼠原代神经干细胞培养 取出15.5 d胎鼠的大脑，左手镊子戳住胎鼠的眼睛，右手镊子在大脑的中部划破，去除小脑、嗅球、海马以及表面的血管后剥离出大脑皮层，剪刀剪碎组织，用细胞分离液消化组织块15 min，用剪去尖头的1 ml枪头吹下已被消化松散的表层单细胞，800 r/min(转子半径12.72 cm)离心3 min后重悬铺于多聚赖氨酸包被液包被过的细胞培养皿上培养以去除过多的细胞碎片，24 h后消化下培养皿中的细胞移入加入神经干细胞培养基(2% B27，0.5%双抗，1%谷氨酰胺，20 ng/ml 表皮生长因子，20 ng/ml重组鼠碱性成纤维细胞生长因子)的培养瓶中扩大培养，等成球(2～4 d)后可正常维持贴壁或者悬浮培养。根据GFAP免疫荧光染色，分化星形胶质细胞的阳性细胞比例大于90%。

神经干细胞分化星形胶质细胞并鉴定 用5% FBS-DMEM处理神经干细胞48 h，甲醛固定，5% BSA封闭，GFAP孵育过夜，抗小鼠二抗 594 nm室温孵育，显微镜下观察分化情况。

不同细胞因子处理细胞并用Western blot检测蛋白的表达 用浓度为20 ng/ml细胞因子处理细胞48 h，收取细胞，用细胞裂解液裂解细胞样品，致使细胞呈黏稠透明液体，加入蛋白缓冲液，95℃变性5 min，后用BCA法进行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白，用240 mA进行恒流转膜，后用相应抗体进行检测。

Agilent 小鼠表达谱芯片检测细胞基因表达 胰酶消化细胞，Trizol裂解液重悬细胞，利用Agilent 公司的小鼠基因表达微阵列，8×60K芯片，检测小鼠物种的基因表达谱。对照组(分化的星形胶质细胞)和处理组(原代星形胶质细胞和加入TGF-β处理的分化星形胶质细胞)各3个平行重复样本。利用Agilent相应的软件对基因芯片数据进行标准化处理，得到具有生物学意义的基因表达量的变化，并利用t检验进行单因素统计分析，比较两组的差异基因。将P<0.05的阳性结果进行后续的通路分析。

统计学处理 利用GraphPad Prism 5统计软件[6]进行统计和作图，实验数据以均数±标准误表示，多组比较采用ANOVA one way检验，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

不同培养方式制备的星形胶质细胞形态和GFAP表达量的变化 神经干细胞分化的星形胶质细胞具有分支多、分裂缓慢等特点(图1A)；而原代培养的星形胶质细胞在光学显微镜下分裂迅速，缺少分支，镜下呈成纤维样形态(图1B)。并且神经干细胞分化的星形胶质细胞GFAP的荧光表达较弱(图1C)，而原代培养的星形胶质细胞在免疫荧光染色中GFAP荧光表达更强(图1D)。

不同细胞因子处理2种细胞后GFAP表达量的变化 用10种不同细胞因子(IL-1、IL-6、IL-12家族，肿瘤坏死因子，TGF以及IFN家族)处理原代星形胶质细胞和神经干细胞分化的星形胶质细胞，结果显示TGF-β能使分化星形胶质细胞的GFAP发生显著升高(图2A)；而所有细胞因子处理原代星形胶质细胞后GFAP均无变化(图2B)。统计结果显示，经过与内参蛋白Hsp90的表达量进行校正后，TGF-β可使GFAP升高约3倍(图2C)。

表达谱芯片分析结果 进一步将原代星形胶质细胞、分化星形胶质细胞以及TGF-β处理的分化星形胶质细胞进行表达谱分析，将芯片结果中具有统计学意义的差异表达基因进行整理后发现原代星形胶质细胞中GFAP、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)、谷氨酸/天冬氨酸逆向转运体(glutamate-aspartic acid transporter，xCT)、神经调节蛋白-1(neuregulin，NRG)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)和整合素3等基因的表达水平均显著高于分化的星形胶质细胞(GFAP升高约5.5倍、GS升高约3.9倍、xCT升高约2.4倍、NRG升高约2.2倍、NMDA升高约2.5倍、LPL升高约2.3倍、整合素3升高约4.6倍)。通过TGF-β处理诱导分化星形胶质细胞由静息态向反应态转变，结果显示在处理48 h后，GFAP、NRG、NMDA、LPL等表达均升高(GFAP升高约1.3倍、NRG升高约2.8倍、NMDA升高约2倍、LPL升高约2.1倍)，同时，与细胞增殖相关基因的表达水平也明显高于未经TGF-β处理的分化星形胶质细胞(表1)。

讨 论

反应态星形胶质细胞增生的出现是所有脑疾病的标志性病理改变[7-8]。细胞因子的分泌、代谢的紊乱、神经退行性疾病的发生发展、细胞的损伤和死亡等多种方式激活的炎症反应是导致星形胶质细胞变为反应态星形胶质细胞的主要诱因[9-11]。

GFAP：胶质纤维酸性蛋白

GFAP：glial fibrillary acidic protein

A.分化的星形胶质细胞有多个分支；B.原代星形胶质细胞具有扁平的成纤维细胞样形态；C.GFAP免疫荧光染色的分化星形胶质细胞；D.GFAP免疫荧光染色的原代星形胶质细胞

A.the differentiated astrocytes have extended multiple processes；B.the primary astrocytes have flat and fibroblast-like morphologies；C.the differentiated astrocytes immunostaining with GFAP；D.the primary astrocytes immunostaining with GFAP

图1 2种体外培养细胞的形态以及GFAP表达量(×100)

Fig 1 Morphology and GFAP expression of two types of cultured astrocytes(×100)

TGF-β：转化生长因子-β；Ctrl：对照组；IL：白介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IFN：干扰素；GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；Mr：相对分子质量；与对照组比较，at=6.093，aP<0.001

TGF-β：transforming growth factor-β；Ctrl：control；IL：interleukin；TNF-α：tumor necrosis factor-α；IFN：interferon；GM-CSF：granulocyte-macrophage colony stimulating factor；Mr：relative molecular mass；at=6.093，aP<0.001 compared with control group

A.分化的星形胶质细胞中TGF-β表达增加；B.原发性星形胶质细胞TGF-β表达无变化；C.与正常对照组相比，用TGF-β处理的分化星形胶质细胞GFAP表达升高；D.与正常对照组相比，用TGF-β处理的原代星形胶质细胞GFAP表达无变化

A.TGF-β increases in differentiated astrocytes；B.the primary astrocytes show no change in TGF-β expression；C.GFAP expression increases in differentiated astrocytes treated with TGF-β(compared with normal controls)；D.GFAP expression show no change in primary astrocytes treated with TGF-β(compared with normal control)

图2 不同细胞因子处理2种星形胶质细胞GFAP表达变化

Fig 2 Changes of GFAP expression in two astrocyte types treated with different cytokines

表1 京都基因与基因组百科全书富集性分析结果Table 1 Results of Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis

本研究通过啮齿类大脑神经胶质细胞分离培养法分离出纯度较高的原代星形胶质细胞和分化星形胶质细胞，通过比较形态学实验和免疫荧光结果显示原代星形胶质细胞具有分裂迅速、胞体较大、分枝较少且GFAP表达量较高等特点，这与高度分化的反应态星形胶质细胞状态类似。而神经干细胞分化而来的星形胶质细胞基本不具分裂能力，胞体相较于原代细胞小，分枝多，且GFAP表达量低，这与分化早期的静息态星形胶质细胞状态类似。

基因表达谱芯片检测结果显示，原代星形胶质细胞中GS、xCT、NRG、NMDA、LPL和胶质纤维酸性蛋白GFAP等基因的表达水平均显著高于分化的星形胶质细胞，表明原代星形胶质细胞相较于分化星形胶质细胞更近似进入反应态。

结合前人报道[1-2]，笔者认为原代培养方式培养的星形胶质细胞就是一种处于反应态的星形胶质细胞，因此，不适合作为一种普通的星形胶质细胞研究其在不同细胞因子作用下的反应情况；而经神经干细胞诱导分化的星形胶质细胞目前研究较少，其与原代星形胶质细胞的差异也知之甚少，本研究比较原代星形胶质细胞和分化星形胶质细胞，表明原代星形胶质细胞确实处于一种反应态，而分化的星形胶质细胞则未进入反应态。用多种细胞因子处理2种细胞后，筛选出一种可以使分化的星形胶质细胞向反应态过渡的细胞因子—TGF-β，从而获得了一种研究反应态星形胶质细胞功能的体外细胞模型。

综上，本研究通过比较原代培养的星形胶质细胞和神经干细胞分化的星形胶质细胞，为探究不同状态的星形胶质细胞功能提供了可能，使我们对星形胶质细胞在疾病中的作用有了更全面的了解，并对靶向星形胶质细胞的疾病治疗提供了帮助。