核受体RORβ在前列腺癌细胞中的表达及其对肿瘤多细胞球形成的影响

张建文,王宏亮,邓 琼,梁 辉,王 铸

(深圳市龙华区人民医院泌尿外科,广东深圳 518109)

前列腺癌是全球男性发病率最高的癌症之一,死亡率位居男性肿瘤的第2位[1-2],并且其发病率还在不断攀升。统计分析认为,到2030年,在高于65岁的男性人群中前列腺癌患者将占到19.6%[3]。近年来,随着我国社会经济的发展、生活条件的不断改善、老年人口比例的逐渐增多以及临床诊断技术水平的快速提高,前列腺癌的发病率在我国男性人群中逐年升高[4]。

前列腺癌病情易被忽视,晚期前列腺癌恶化速度显著加快,通常都会发展成为去势抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)并且容易转移到其他内脏器官,例如骨骼和淋巴结[5-6]。面对晚期症状性CRPC,目前临床上基本没有有效的治疗手段,预后极差[7]。到目前为止,前列腺癌的确切发病以及进展机制尚未完全清楚。因此,对于前列腺癌的研究，尤其是对CRPC发生发展机制的研究十分迫切。本研究中发现维甲酸相关的孤儿核受体β(retinoic acid-related orphan receptor β,RORβ)在前列腺癌组织中显著上调表达,并且在前列腺癌肿瘤干细胞富集的肿瘤多细胞球中表达水平进一步升高。我们还构建了基于VCaP细胞的CRPC小鼠模型,发现在肿瘤复发阶段RORβ表达水平显著高于去势之前的肿瘤标本。我们在VCaP-CRPC模型的肿瘤复发阶段,发现了肿瘤干细胞相关标记物阳性细胞比例显著高于去势之前的肿瘤标本。通过外源性过表达的方式在前列腺癌细胞中过表达RORβ的表达水平,并通过肿瘤多细胞球形成实验,以及抗雄激素药物处理发现RORβ过表达的前列腺癌细胞具有显著增强的肿瘤多细胞球形成能力,并具有更强的抗雄激素药物耐受能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料前列腺癌细胞株DU145、LNCaP和VCaP购自美国模式培养物集存库,分别用含有10%胎牛血清(forward-based system,FBS)的MEM培养基(Gibco minimum eagle’s media,MEM),RMPI1640(Gibco RPMI 1640 medium)以及DMEM培养基(Gibco Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培养。鼠抗人RORβ单抗购自Abcam公司(货号：ab228650),鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz生物科技公司(货号：sc-47778)；RORβ基因的表达克隆从DNASU Plasmid Repository购买(ID：HsCD00300034)。

1.2 实验方法

1.2.1前列腺癌多细胞球培养 前列腺癌细胞通过胰酶(0.05% Trypsin-EDTA)消化成单个细胞后,用PBS洗3次,DMEM/F12培养基[添加10 ng/mL表皮生长因子,10 ng/mL 碱性成纤维细胞因子,2% B-27(体积分数),5 μg/mL胰岛素,1%敲除替代血清(体积分数),1%青霉素和链霉素(体积分数)]重悬,按照1×105个细胞接种到100 mm超低吸附培养皿(ultra-low attachment dishes and plates,康宁,美国)。37 ℃条件下培养5 d后,每2～3 d更换培养基至2周,用孔径80 μm的滤膜过滤收集细胞球用于后续实验研究。

1.2.2VCaP-CRPC动物模型建立 将前列腺癌VCaP细胞(2×106个细胞/50 μL与基质胶1∶1混合)皮下注射到6～8周龄雄性严重免疫力缺乏综合症(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠体内,每周观察并测算肿瘤体积1次,肿瘤体积约0.8 cm3时,宿主小鼠被麻醉并施行去势手术,正常饲养至约14周,复发的肿瘤异种移植物生长至约1.2 cm3,施行麻醉过量人道处死小鼠并去除瘤体。分别在进行去势手术前,去势后4 d以及去势后8周(肿瘤去势复发)收取肿瘤标本,用于RORβ基因mRNA以及蛋白表达分析。

1.2.3Oncomine数据分析 在Oncomine(http:∥www.oncomine.org)分析中,使用癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,在前列腺癌临床样本和正常前列腺组织中分析RORβ基因的mRNA表达水平。用于分析的参数包括RORβ(NR1F2)为基因名称,以前列腺癌为分析对象,以癌症与正常组织中的表达水平作为分析类型。用于查询微阵列数据阈值：包括癌组织和正常组织之间的表达差异>2,P<1×10-4。

1.2.4RORβ过表达载体构建 RORβ基因克隆购自DNASU Plasmid Repository(Arizona State University),通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获取全长cDNA,并将其克隆入慢病毒质粒pLenti-puro进行过表达研究。将构建的pLenti-RORβ质粒转染到293FT细胞进行慢病毒包装制备(实验组),空的pLenti-puro载体包装作为阴性对照(对照组)。包装好的病毒分别用来感染LNCaP和DU145细胞,分别通过实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分析验证RORβ蛋白水平的表达。

1.2.5RT-PCR实验 使用抽提试剂(Trizol)法提取细胞以及肿瘤组织总RNA,并用脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)处理。使用PrimeScript RTase和oligo-dT(PrimeScript RT Master Mix,TaKaRa)的混合物在37 ℃下15 min合成第一链cDNA,然后在85 ℃下5 s热灭活逆转录酶(RTase)。使用荧光定量检测试剂盒绿色荧光的方法进行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)。通过混合25 ng cDNA,150 nmol/L引物对和荧光定量混合物(SYBR Premix Ex Taq,ROX Plus,TaKaRa)并在实时PCR系统(StepOne,Applied Biosystems)中以95 ℃ 20 s进行PCR反应,随后再以95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s为一个循环周期进行40次。

1.2.6Western blot实验 使用冷裂解缓冲液(20 mmol/L PIPES,0.1%十二烷基硫酸钠,1 mmol/L乙二胺四乙酸,1 mmol/L乙二醇双四乙酸,10 mmol/L一硫代甘油,1 mmol/L蛋白酶抑制剂,5 mmol/L亮抑酶肽,0.25 mol/L蔗糖)提取全细胞蛋白。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离和转印到聚偏氟乙烯膜上后,一级和二级抗体孵育,随后用免疫印迹检测系统(ECL Western blotting detection system,amersham)检测。

1.3 统计学分析统计学处理采用SPSS 13.0软件。定量资料进行单因素方差分析(One-way ANOVA),方差不齐者采用秩和检验分析,样本间的两两比较采用最小显著性差异法(least significant difference,LSD)方法分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RORβ在前列腺癌组织中表达水平显著升高通过生物信息学方法分析发现RORβ在前列腺癌临床样本中的表达水平显著升高(图1)。在两个独立的研究中,分别调查了65例和27例前列腺癌临床样本,正常前列腺对照组分别有23例和8例。研究发现,相对于正常前列腺组织,RORβ在前列腺癌组织中显著升高(P<0.001)。

图1 RORβ在前列腺癌组织中表达水平升高

2.2 RORβ在前列腺癌多细胞模型中的表达水平显著升高分析RORβ基因在前列腺癌细胞LNCaP、VCaP以及DU145细胞多细胞球(prostatospheroids)中的表达(图2A、B)。结果显示,无论是雄激素依赖型(LNCaP、VCaP)还是雄激素非依赖型细胞株(DU145)形成的多细胞球,RORβ基因都发生了显著的上调表达,其中在LNCaP细胞中的表达上调最为显著(图2C,P<0.001),Western blot验证了RORβ在蛋白水平的上调表达(图2D)。

图2 RORβ在前列腺癌多细胞模型中的表达水平显著升高

2.3 RORβ在前列腺癌去势抵抗动物模型中的表达水平显著升高我们通过构建CRPC小鼠模型,分析RORβ在CRPC小鼠模型的各个阶段的表达情况,结果显示在去势过程中,RORβ表达显著上调,随着肿瘤的复发RORβ表达水平有所下降,但仍然显著高于去势手术前的表达水平(图3A)。在去势手术后CRPC小鼠模型各个阶段肿瘤标本中肿瘤干细胞相关标记物(CD44、CD133、OCT4、CK5等)的表达水平显著升高(图3B)。另外,在CRPC模型中RORβ蛋白表达水平显著升高(图3C)。我们通过流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分析VCaP-CRPC组织标本中CD44+/CD133+细胞,结果显示CD44+/CD133+阳性细胞比例显著升高。

图3 RORβ在前列腺癌去势抵抗动物模型中的表达水平显著升高

A：RORβ在VCaP-CRPC模型中的表达水平；B：VCaP-CRPC模型中前列腺癌干细胞标记物表达,*P<0.05,**P<0.001；C：VCaP-CRPC模型中RORβ蛋白表达水平。

2.4 RORβ在前列腺癌细胞中的过表达促进前列腺癌肿瘤干细胞富集的多细胞球的形成通过构建RORβ真核表达载体,我们分别在DU145(雄激素非依赖型细胞)和LNCaP(雄激素依赖型细胞)细胞中外源性过表达RORβ,在mRNA以及蛋白水平的表达(图4A、B),RORβ的过表达显著促进前列腺癌肿瘤干细胞富集的肿瘤多细胞球的形成(图4C、D)。

图4 RORβ在前列腺癌细胞中的过表达促进前列腺癌肿瘤干细胞富集的多细胞球的形成

A、B：RORβ过表达载体在DU145和LNCaP细胞中的表达验证；C、D：RORβ过表达促进DU145和LNCaP多细胞球的形成。*P<0.05,**P<0.001。

3 讨 论

前列腺癌干细胞(prostate cancer stem cell,PCSC)被认为是前列腺癌的起始细胞,不仅可以分化成前列腺癌细胞,还具有自我更新能力,保持自身在肿瘤细胞中的一定比例。前列腺癌干细胞因对化疗和放疗不敏感,而且雄激素受体表达阴性,对雄激素治疗不敏感,是导致前列腺癌复发以及CRPC进展的重要机制[10]。

本项研究中,我们发现核受体RORβ在前列腺癌细胞以及CRPC动物模型中显著上调表达,并且通过真核载体外源性的上调RORβ表达可以显著促进前列腺癌干细胞富集的肿瘤多细胞球的形成。核受体是一类转录因子超家族,其通过配体依赖性或者配体非依赖性的方式调控下游基因表达,在新陈代谢、生殖、发育等生理过程中起着重要的作用[11]。RORβ可能通过调节肿瘤干细胞相关信号通路和蛋白因子从而介导了前列腺癌干细胞的自我更新和分化。因此,RORβ可能成为治疗CRPC潜在的新靶点。

研究发现,核受体配体结合域可以被天然代谢产物、激素或者小分子药物结合,并由此调节其转录活性,因此被认为是癌症治疗的理想靶点。例如糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)可以拮抗雄激素受体(androgen receptor,AR)信号通路,因此GR通常也作为单独化疗或者联合治疗手段应用于CRPC的治疗[12-13]；维生素D受体可以和AR信号通路发生交互作用,调节雄激素代谢过程并抑制前列腺癌细胞的增殖[14]。到目前为止,已经有多种靶向核受体的小分子药物上市或者进入临床试验。例如靶向雌激素受体(estrogen receptor,ER)的小分子雌激素拮抗药它莫西芬(Tamoxifen)和特异性更高的雷洛昔芬(Raloxifene),被用于治疗乳腺癌[15],靶向AR的非甾体类小分子药物Flutamide、Bicalutamide、MDV-3100,被用于治疗前列腺癌[16],靶向核受体PPARs的激动剂(Thiazolinediones,TZDs)被用于治疗2型糖尿病、脂肪肉瘤和结肠癌[17]等。

RORβ属于孤儿核受体家族,在维持各种生理过程和生理节律方面起着重要的调节作用[16]。昼夜节律异常越来越被认为是肿瘤发生的重要诱因[18-19]。因此,阐明RORβ的分子机制,调节肿瘤相关昼夜节律异常可能对有效干预和阻断异常昼夜节律诱导的肿瘤发生产生重要的临床益处[18]。目前RORβ基因异常表达与人类癌症的发生、发展的关系日益受到关注。RISINGER等[21]对79例子宫内膜癌以及12例1期浆液性子宫内膜癌研究发现,相对于正常子宫内膜组织,RORβ在组织中显著低表达[20]。另外,研究表明在结直肠癌中也发现RORβ在癌组织中显著下调表达。然而,DAVIDSON等[20]在原发性子宫肌肉瘤中发现RORβ表达显著上调。但是,RORβ激活或者抑制肿瘤生长的调控机制尚不明确。

有研究通过mRNA FISH和RT-PCR方法检测发现RORβ在胃癌组织中下调,RORβ通过与Nrip2/Rorl3/HBPl分子间的相互作用影响Wnt/β-catenin信号通路活性而调控大肠癌细胞自我更新[21-23]。Wnt/β-catenin可以直接作用于肿瘤干细胞因子Nanog和Oct4启动子上调其表达水平,从而促进肿瘤干细胞干性维持过程[24]。因此RORβ促进前列腺癌多细胞球的形成可能与Wnt/β-catenin信号以及Nanog和Oct4的表达调控有关。另外,GREINER等[25]新发现NIX1通过第61～99个氨基酸与RORβ相互作用,直接结合RORβ且特异性地抑制其活性。RORβ的异常表达可能与其上游信号,包括NIX1的表达有关。

综上所述,核受体RORβ在前列腺癌细胞以及CRPC动物模型中上调表达,并可能通过Wnt/β-catenin信号通路介导Nanog以及Oct4的表达从而促进前列腺癌干细胞富集的多细胞球的形成。这表明RORβ很可能通过调控前列腺癌干细胞干性从而促进了前列腺癌去势抵抗进展,提示核受体RORβ有可能是一个潜在的前列腺癌进展标记物和治疗靶点,但是其相关信号通路以及调控机制仍不清楚亟待进一步研究。