外源褪黑素对NaCl胁迫下扁穗雀麦种子萌发及幼苗的影响

熊艳丽，熊 毅，赵文达，杨晓鹏，雷 雄，余青青，马 啸，张新全

（四川农业大学动物科技学院草业科学系，四川 成都 611130）

土壤盐碱化是农业发展所面临的主要危机之一[1]。盐胁迫下植物细胞内线粒体和叶绿体通过电子传递产生过量活性氧，导致OH-、H2O2等自由基的大量积累，引起细胞膜的脂质过氧化、蛋白质变性、色素分解和碳水化合物氧化，从而对植物生长发育造成不利影响[2]。植物虽能通过防御系统清除活性氧，但在盐胁迫等逆境条件下植物的防御系统和活性氧水平失衡，从而引起氧化胁迫[3]。扁穗雀麦(Bromus catharticus)为禾本科(Poaceae)、雀麦属(Bromus)一年生或越年生草本植物，它产量稳定、适口性好、绿期长，能有效解决南方冬春牧草供应不足的问题，在烟草轮作、果草间作、粮草轮作上有良好的应用前景[4]。扁穗雀麦主要被引种栽培于我国华东、江苏等地，但其能否在含盐量较高的地方种植还不得而知。因此，通过技术措施提高扁穗雀麦的抗盐性有利于其在盐碱地分布地区的推广利用。

为了提高牧草产量、维持农业发展的可持续性，许多植物生长调节物质已经被用于提高植物的耐盐性，如甜菜碱、水杨酸(salicylic acid, SA)、维生素C等。在过去30年里，科学家证明了褪黑素对于动物具有调节基因表达、影响抗氧化酶活性、调控抗氧化酶mRNA水平、抗氧化以及调节昼夜节律的作用[5]。近年来在植物中也发现了褪黑素的存在，并证明其对植物抵御高温[6]、重金属[7]和低温[8]胁迫发挥着重要作用。不仅如此，褪黑素(melatonin, MT)还具有促进种子萌发[9]、提高保护酶活性[10]与增强清除活性氧能力[11]的功能。这证明了外源MT的施加对缓解植物盐胁迫的可行性。然而迄今为止，MT对盐胁迫下扁穗雀麦种子萌发及其抗氧化系统的影响尚未见报道。因此，本研究以扁穗雀麦为研究材料，探究外源MT对盐胁迫下扁穗雀麦种子萌发及其幼苗的形态和生理指标的影响，旨为MT应用于植物抗逆和盐胁迫下扁穗雀麦的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

扁穗雀麦品种‘川西'(四川省2017年审定品种)，由四川农业大学牧草课题组提供，2016年收种于四川雅安并保存于-20 ℃冰箱，发芽率约为95%。种子在试验前用2%的NaClO消毒30 min，冲洗干净后用蒸馏水浸种24 h。褪黑素产于上海广瑞生物有限公司，纯度为分析纯。

1.2 适用NaCl浓度的筛选和MT浓度的选择

设置0.2%、0.4%、0.6%、0.8%共4个不同的NaCl浓度，每个处理4个重复，每个重复50粒种子，选择使发芽势降低为对照60%时的NaCl处理浓度作为正式试验的最佳胁迫浓度，因为发芽势太高难以体现MT的作用，而太低则会导致后续指标测定困难。同时参照我国土壤盐渍化等级标准(土壤溶液含盐量 ＞ 0.37%为强盐渍土)，最终将正式试验胁迫盐浓度设置为0.4%。MT处理浓度分别为50、100、300、500 和 1 000 μmol·L-1。

1.3 植物材料培养与处理

消毒浸种后，选取饱满均一的扁穗雀麦种子，放于10 cm × 10 cm的方形培养皿中，内铺两层无菌滤纸。每处理重复4次，每重复50粒种子。每个培养皿加入约5 mL处理液，放于日温25 ℃ (16 h)、夜温15 ℃ (8 h)的培养箱中，每2 d更换滤纸，盖上培养皿塑料盖并用保鲜膜封住来尽量降低因水分蒸发而引起的干旱。CK1：于蒸馏水中萌发。CK2：于0.4% NaCl溶液中萌发。MT处理：于50、100、300、500、1 000 μmol·L-1溶液中萌发，分别用MT50、MT100、MT300、MT500和MT1000表示。CK2+ MT：于CK2和MT的混合溶液中萌发，即CK2+ 50、100、300、500和 1 000 μmol·L-1的混合溶液，分别用 NaCl+MT50、NaCl+MT100、NaCl+MT300、NaCl+MT500、NaCl+MT1000表示。混合溶液配制：在100 mL蒸馏水中加入4 g NaCl，再加入不同质量的MT定容至1 000 mL。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 萌发指标测定

培养期间每天定时测定种子发芽率，以胚根露出2 mm作为萌发状态，在发芽高峰期(第5天)统计发芽势，发芽率不再变化后统计发芽率(第10天)，并测定扁穗雀麦的苗鲜重、根鲜重(苗鲜重、根鲜重记录为10株幼苗的总重)、苗高、根长(苗高、根长记录为10株幼苗的平均值)。发芽率发芽势按如下公式计算：发芽势 = 5 d内种子发芽数/供试种子数 × 100%，发芽率 = 10 d内种子发芽数/供试种子数 × 100%。

1.4.2 生理指标测定

剪取萌发10 d的幼苗，用液氮快速冷冻后放于-80 ℃冰箱超低温保存。参照《植物生理学实验教程》[12]测定游离脯氨酸(Pro)含量，采用硫代巴比妥酸法[13]测定过氧化产物丙二醛(MDA)含量，采用考马斯亮蓝法[14]测定可溶性蛋白含量，采用愈创木酚法[15]测定过氧化物酶(POD)活性。

1.5 数据处理

采用Excel 2010 和SPSS statistics 19.0进行数据汇总与数据分析，Excel 2003进行图表绘制。对不同处理的数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan新复极差法进行多重比较(P ＜ 0.05)。数据以平均值 ± 标准差表示。为筛选出施用效果最好的外源MT浓度，对扁穗雀麦所有处理的形态指标和生理指标进行隶属函数综合评价，计算公式为[16]：正向隶属函数值 = (X - Xmin) / (Xmax- Xmin)，负向隶属函数值 = 1 - (X - Xmin) / (Xmax- Xmin)，式中，X为某一指标测定值，Xmax和Xmin表示此指标的最大值与最小值。本研究中MDA含量为负向指标，其余指标为正向指标。

2 结果与分析

2.1 适用NaCl浓度的筛选

采用蒸馏水(CK1)处理的扁穗雀麦种子发芽势(第5天)为66% (图1)，随着NaCl浓度的升高，种子的发芽势逐渐降低。处理浓度为0.4%时发芽势降低至44%，为CK1的60%左右，因此选用0.4%的NaCl作为正式试验的胁迫浓度。

2.2 MT对盐胁迫下扁穗雀麦种子发芽率和发芽势的影响

CK2处理下种子发芽率为76%，较CK1处理时(93%)显著降低 (图 2A)。无 NaCl胁迫下，100～500 μmol·L-1MT 处理的发芽率与 CK1处理差异不显著 (P ＞ 0.05)，1 000 μmol·L-1MT 处理的发芽率显著降低至80% (P ＜ 0.05)。NaCl胁迫下，随着MT浓度升高种子发芽率呈现出先上升后下降的趋势，但均显著高于 CK2(P ＜ 0.05)，100 μmol·L-1MT 时发芽率最高(93%)。

图 1 NaCl处理对扁穗雀麦种子发芽势的影响Figure 1 Effects on germination energy of rescuegrass seeds under NaCl stress不同小写字母表示不同处理间差异显著(P ＜ 0.05)。图2、3、4同。Different letters indicate significant differences between different treatments at the 0.05 level； similarly for Figure 2, 3, and 4.

CK2处理下种子发芽势为42.5%，较CK1处理(66%)显著降低 (P ＜ 0.05) (图 2B)。无 NaCl胁迫下，50～500 μmol·L-1MT 处理的发芽势较 CK1有所提高，其中500 μmol·L-1MT处理时发芽势提高幅度最大，发芽势达 73.5%；1 000 μmol·L-1MT 时发芽势反而下降至50.5%，表明高浓度MT会抑制扁穗雀麦种子的萌发。NaCl胁迫下，相对于CK2处理，添加MT处理的发芽势呈先上升后下降的趋势，其中300 μmol·L-1MT处理时发芽势最高，为71.5%。

2.3 MT处理对盐胁迫下扁穗雀麦形态指标的影响

2.3.1 MT对扁穗雀麦根长、根鲜重、苗高和苗鲜重的影响

CK2处理下，根长与根鲜重较CK1处理时显著降低(P ＜ 0.05)(表1)。无NaCl胁迫下，与CK1相比，MT处理的根长、根鲜重随MT浓度增加呈先上升后下降的趋势，100 μmol·L-1MT处理时根长和根鲜重达到最大值，分别为9.41 cm和0.078 g。NaCl胁迫下，添加不同浓度MT处理的根长与根鲜重随MT浓度增加较CK2也呈先上升后下降的趋势，且根长、根鲜重分别在MT浓度为50、100 μmol·L-1时达到最大值。

图 2 外源MT处理对NaCl胁迫下扁穗雀麦种子发芽率和发芽势的影响Figure 2 Effects of exogenous melatonin on germination rate and germination energy of rescuegrass seeds under NaCl stress不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。CK1：蒸馏水；CK2：0.4% NaCl溶液；MT50：50 μmol·L-1 褪黑素；MT100：100 μmol·L-1褪黑素；MT300：300 μmol·L-1 褪黑素；MT500：500 μmol·L-1 褪黑素；MT1000：1 000 μmol·L-1 褪黑素；NaCl+MT50：0.4% NaCl+50 μmol·L-1褪黑素；NaCl+MT100：0.4% NaCl+100 μmol·L-1 褪黑素；NaCl+MT300：0.4% NaCl+300 μmol·L-1 褪黑素；NaCl+MT500：0.4% NaCl+500 μmol·L-1褪黑素；NaCl+MT1000:：0.4% NaCl+1 000 μmol·L-1褪黑素。表 1、2，图 3、4 同。Different lowercase letters indicate significant difference between different treatments at the 0.05 levels. CK1: H2O； CK2: 0.4% NaCl； MT50: 50 μmol·L-1；MT100: 100 μmol·L-1melatonin； MT300: 300 μmol·L-1 melatonin； MT500: 500 μmol·L-1 melatonin； MT1000: 1 000 μmol·L-1 melatonin； NaCl+MT50: 0.4%NaCl+50 μmol·L-1melatonin； NaCl+MT100: 0.4% NaCl+100 μmol·L-1melatonin； NaCl+MT300：0.4% NaCl+300 μmol·L-1 melatonin； NaCl+MT500: 0.4%NaCl+500 μmol·L-1 melatonin； NaCl+MT1000: 0.4% NaCl+1 000 μmol·L-1 melatonin； similarly for Table 1 and Table 2, Figure 3 and Figure 4.

表 1 外源MT对NaCl胁迫下扁穗雀麦根、苗的影响Table 1 Effect of exogenous melatonin on roots and seedlings of rescuegrass under NaCl stress

CK2处理下，苗高与苗鲜重较CK1处理时显著降低(P ＜ 0.05)。无NaCl胁迫下，MT处理的苗高、苗鲜重与CK1相比变化趋势和前述根长、根鲜重相似，分别在300、100 μmol·L-1MT时达到最大值。NaCl胁迫下，不同浓度MT处理的苗高、苗鲜重均较 CK2显著上升 (P ＜ 0.05)，100 μmol·L-1MT 处理时苗高和苗鲜重达到最大值，分别为6.36 cm和0.121 g (表 1)。

不同处理下，扁穗雀麦4个表型性状的变异系数范围为16.20% (苗高)～53.70% (根鲜重)。其中，根长和根鲜重的变异幅度较大且变异系数在40%以上，表明相比于苗，根对不同处理的反应存在更大差异。

2.3.2 MT对扁穗雀麦根冠比的影响

CK2处理下，幼苗的根冠比与CK1处理相比增加了 27.13%(P ＜ 0.05） (图 3)。无 NaCl胁迫下，50～500 μmol·L-1MT 处理种子时幼苗根冠比较 CK1处理 的增幅为 41.64%～ 51.54%， 其 中 500 μmol·L-1效果最显著 (P ＜ 0.05)。NaCl胁迫下，100 μmol·L-1MT时根冠比较CK2和CK1处理分别增加了10.44%和 34.74%；添加 1 000 μmol·L-1MT 时根冠比下降至0.069，显著低于 CK2和 CK1处理 (P ＜ 0.05)。

2.4 MT对扁穗雀麦幼苗生理指标的影响

图 3 外源MT处理对NaCl胁迫下扁穗雀麦根冠比的影响Figure 3 Effect of exogenous melatonin treatment on shoot to root ratio of rescuegrass under NaCl treatment

CK2处理下，幼苗Pro含量和POD活性与CK1差异不显著(图4A、B)。无NaCl胁迫下，MT处理下幼苗的Pro含量和POD活性与CK2和CK1相比均随MT浓度增加呈先上升后下降的趋势，其中300、500 μmol·L-1的 MT 处理后幼苗中 Pro 含量和 POD活性达到最大值。NaCl胁迫下，100、300 μmol·L-1MT处理的幼苗Pro含量和POD活性达到最大值。

图 4 外源MT处理对NaCl胁迫下扁穗雀麦幼苗生理指标的影响Figure 4 Effect of exogenous melatonin on physiological indexes of rescuegrass seedlings under NaCl stress

CK2处理下，幼苗MDA和可溶性蛋白含量较CK1显著增加(图4C、D)。无NaCl胁迫下，MT处理下幼苗可溶性蛋白与MDA含量较CK1均随MT浓度增加呈先上升后下降的趋势，分别在100和50 μmol·L-1MT时达到最大值。NaCl胁迫下，添加MT处理的幼苗可溶性蛋白含量与CK2相比亦随MT浓度增加呈先上升后下降的趋势，300 μmol·L-1MT处理时达到最大值；添加不同浓度MT处理的幼苗MDA含量较CK2处理均显著下降(P ＜ 0.05)。

2.5 不同处理下扁穗雀麦抗盐性的隶属函数分析与综合性评价

使用单一指标分析扁穗雀麦的抗盐性具有片面性，采用隶属函数计算得到的值为0～1区间内的纯数，可以克服少数指标评价的不足，使各项指标具有可比性。再结合权重对每一处理各指标的隶属函数值求和可对各处理进行综合性评价。权重的计算借助主成分分析完成，即通过计算指标在各主成分线性组合中的系数和主成分的方差贡献率，并进行指标权重的归一化来算出各指标在各处理中所占权重。权重分析可得，发芽率、发芽势和苗鲜重贡献率最大。隶属函数综合分析结果显示，抗盐性排序：CK2+ 100 μmol·L-1MT ＞ CK2+ 300 μmol·L-1MT ＞CK2+ 50 μmol·L-1MT ＞ CK2+ 500 μmol·L-1MT ＞ CK2+1 000 μmol·L-1MT ＞ CK2(表 2)， 即 添 加 浓 度 为100 μmol·L-1的外源 MT 时效果最好。

3 讨论与结论

盐胁迫是限制植物正常生长发育的环境因子之一[17]，盐离子本身对植物造成的伤害为原初伤害，次生伤害则包括高盐引起植物细胞缺水导致的渗透胁迫，以及高浓度Na+、Cl-对其他离子拮抗而导致植物对必要离子的吸收阻碍引起的营养胁迫[18]。本研究所用梯度浓度的NaCl降低了扁穗雀麦种子的发芽率和发芽势并抑制了幼根幼苗的生长，同时盐胁迫还增加了扁穗雀麦幼苗MDA的含量从而导致膜质过氧化。而在盐胁迫下加入不同浓度的MT均能在一定程度上缓解盐害，如，与单独盐胁迫相比，在其基础上添加100 μmol·L-1的MT提高了扁穗雀麦的发芽率、发芽势以及幼苗中可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)含量和过氧化物酶(POD)活性。

根系的发育、形态和活力对植物营养物质的吸收、新陈代谢及其生理功能有着重要影响，而根冠比则反映了植物地下部分与地上部分的相关性。有研究表明，外源添加MT可诱导植物中柱鞘细胞产生新的根原基，增加不定根的数量、长度以及侧根数目[19]。本研究表明，盐胁迫下根长、根鲜重、苗高和苗鲜重均下降，但根长和根鲜重的下降幅度小于苗高与苗鲜重，而在盐胁迫下添加MT，根长和根鲜重的增加幅度大于苗高与苗鲜重，即在两种处理方式下均表现为根冠比增加，这与添加MT对干旱胁迫下小麦(Triticum aestivum)[20]和樱桃(Cerasus pseudocerasus)[21]作用的研究结果一致。

表 2 扁穗雀麦不同指标隶属函数分析Table 2 Membership function analysis of different indexes of rescuegrass

细胞内膜质过氧化终产物为MDA，会引起蛋白质、核酸等生物大分子的交联聚合并影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性，因此常用MDA含量的高低来衡量植物细胞膜质过氧化程度[22]。本研究表明，扁穗雀麦在受到盐胁迫后MDA含量增加，这可能与OH-、H2O2等活性氧的大量积累有关。植物体内的保护系统能有效清除活性氧，而过氧化物酶(POD)作为体内重要的酶促系统之一，能通过分解H2O2以及某些酚类物质来保护植物细胞膜免受氧化伤害，对维持细胞内活性氧平衡、保护膜质结构和抵抗逆境胁迫有重要意义[23]。Pro和可溶性蛋白是植物体内重要的渗透调节物质，Pro的积累与植物对逆境的耐受能力正相关，可溶性蛋白多是参与植物代谢的各种酶类，其含量是评价植物整体代谢水平的一个重要指标[19]。有研究表明，MT可以通过增加抗氧化酶相关基因的表达以及减少生物大分子的降解来提高POD活性，而增强对活性氧的清除能力[10]，这与本研究结果相符。

MT可以促进无逆境胁迫下植物幼根幼苗的生长，在提高植物产量上发挥作用[24]，而且在盐胁迫下其在提高活性氧清除速率、维持渗透势、降低膜质过氧化方面的效应更大。因此，在实际应用中，还应根据具体的生产条件，合理施用。

综上所述，本研究发现，在NaCl胁迫下，添加100 μmol·L-1的 MT 能有效提高扁穗雀麦种子的发芽势和发芽率，促进幼根幼苗的生长，清除植物体内积累的活性氧，促进可溶性蛋白的合成，维持细胞渗透势以及降低膜质过氧化程度等，这对于提高扁穗雀麦在盐碱地等边际土地上的生产效率具有一定的参考价值。