Ku70蛋白的翻译后修饰在肿瘤研究中的进展

刘 壮 综 述，吴志强，袁智勇 审 校

（天津医科大学肿瘤医院放疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室,天津市恶性肿瘤临床医学研究中心,天津 300060）

Ku70是一个分子量大约70KD的蛋白，在许多细胞信号通路中发挥着重要作用。在DNA双链断裂非同源末端连接修复通路中，Ku70和其家族成员蛋白Ku80形成异二聚体戒指样环状结构，与DNA双链断裂的断端结合，从而促进DNA损伤修复[1-2]，增强肿瘤放疗抵抗。在Ku70参与的Bax介导的细胞凋亡信号通路中，Ku70可以和Bax结合，抑制了Bax向线粒体转移，从而抑制线粒体细胞凋亡通路[3]，抑制肿瘤细胞凋亡。Ku70还参与到端粒的维持，通过保护染色体末端，防止被DNA修复通路错误识别切割，从而维持了基因的完整性。另外，在DNA复制过程中，Ku70也发挥着不可替代的作用。这些功能都与Ku70蛋白的翻译后修饰密切相关（图1，表1）。

表1 Ku70的翻译后修饰

翻译后修饰（post-translational modification,PTMs）是一种氨基酸的化学修饰，例如磷酸化、乙酰化、泛素化、类泛素化等。几乎所有的蛋白都可以发生翻译后修饰，蛋白的翻译后修饰对蛋白的生物学功能有着重要的影响，比如蛋白的定位，生物活性调节、结构和稳定性等[4]。翻译后修饰在肿瘤细胞发生发展以及其它生理、病理过程中，均发挥着重要作用。

到目前为止，大量的研究表明，Ku70的翻译后修饰在肿瘤细胞的增殖、DNA损伤修复、细胞凋亡等过程中发挥着重要作用。本文着重对Ku70蛋白的翻译后修饰在肿瘤研究中的进展进行综述，为肿瘤的防治提供新思路。

1 Ku70蛋白的翻译后修饰及其作用

1.1 磷酸化修饰 近几年来，很多肿瘤相关研究证实了Ku70蛋白许多位点的磷酸化（图1、表1），在肿瘤细胞的DNA损伤修复以及细胞凋亡过程中发挥着重要作用。在真核细胞中，DNA双链断裂是DNA损伤最严重的形式。DNA双链断裂如果不能及时并正确的修复就会引起细胞死亡或者突变，进而导致肿瘤的发生[5]。在肿瘤治疗中，放疗主要通过引发DNA双链断裂杀死肿瘤细胞，而部分化疗药物在一定程度上也依赖药物引起的DNA双链断裂阻断肿瘤细胞的增殖或诱发肿瘤细胞的凋亡。因此，DNA损伤修复是肿瘤细胞产生放化疗抵抗的一个重要原因[6]。DNA双链断裂的修复方式主要包括两种：同源重组修复和非同源末端连接修复[7-9]。非同源末端连接修复由于不需要同源模板，可直接将断裂的断端进行连接，同时可以发生在细胞周期的任何一个时期，因此成为DNA损伤的主要修复方式[5]。

Ku70是DNA损伤非同源末端连接修复通路中的重要分子。在非同源末端连接修复过程中，Ku70和Ku80迅速结合到断裂的双链DNA断端，保护DNA末端，同时募集下游分子蛋白和酶类，包括DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-dependent protein kinase subunit,DNA-PKcs）、Artemis酶、X 射线修复交叉互补蛋白4(X-ray cross-complementing group 4,XRCC4)、XRCC4 类似因子（XLF）、DNA 连接酶4（Lig4）等，促进修复的顺利完成[1-2]。在肿瘤细胞中，当DNA发生双链断裂时，Ku70的S27和S33位点可以被DNA-PKcs或ATM磷酸化，进而促进肿瘤细胞的DNA损伤修复及细胞增殖[10]。Ku70的S155位点也可以被ATM或DNA-PKcs磷酸化，此位点的磷酸化可以增加凋亡相关转录因子ATF2(activating transcription factor 2)的磷酸化，进一步促进肿瘤细胞凋亡[11]。另外S155位点磷酸化的Ku70还可以通过抑制Aurora B激酶的活性，引起的肿瘤细胞周期停滞[12]。另一项研究发现，在Ku70分子的“间桥和支柱”区域有5个磷酸化位点，分别是T305、S306、T307、S314 和 T316，这 5 个位点的磷酸化与Ku70的粘附DNA的能力密切相关，在细胞周期S期，它们的磷酸化促进了Ku70与DNA双链断裂断端的分离，从而使DNA双链断裂修复在S期更倾向于选择同源重组修复[13]。

Ku70的磷酸化修饰还可以调节Ku70和Bax亲和力，由于Bax蛋白与细胞凋亡通路密切相关，因此Ku70的磷酸化也在肿瘤细胞的凋亡过程中发挥着重要作用。研究表明，当Ku70的S6和S51发生磷酸化时，Ku70和Bax亲和力下降，从而引发Bax向线粒体转移，促进肿瘤细胞凋亡[14]。另外，研究者新发现了Ku70的Y530位点磷酸化可抑制K539和K542的乙酰化,间接增强Ku70结合Bax的能力，从而抑制Bax介导的线粒体凋亡[15]。因此抑制Ku70的Y530位点的磷酸化，促进肿瘤细胞凋亡，是一个潜在的肿瘤的治疗靶点。

在肿瘤细胞DNA复制过程中，Ku70可以被细胞周期蛋白激酶磷酸化，参与到DNA复制的起始，保证了肿瘤细胞DNA复制的正常进行。在细胞周期G1期，非磷酸化的Ku70可以结合到DNA复制的起始部位，与Ku80共同募集DNA复制识别起始复合物，为下一步DNA复制做好准备。当细胞周期进入S-M期时，Ku70蛋白的T401、T428和T455位点受到细胞周期蛋白激酶如周期蛋白A1-CDK2、A2-CDK2等磷酸化，引起Ku70/80的脱落，从而避免了DNA重复复制[16]。另外，Ku70的T58位点也可以被细胞周期激酶E1-CDK2磷酸化[16]，该位点的磷酸化可能有另外的功能，需要进一步研究。

1.2 乙酰化修饰 在非同源末端连接修复中，Ku70和Ku80首先发现并粘附到断裂的双链DNA断端对于起始非同源末端连接修复至关重要。而Ku70的乙酰化对其粘附活性有重要影响。有研究者探究发现在肿瘤细胞核中，Ku70的K282、K338、K539和K542位点（图1，表1）的乙酰化受到组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的调节，这些位点的非乙酰化状态增强了Ku70的粘附DNA双链断端的能力，从而增强了肿瘤细胞的抗DNA损伤修复的能力。因此，运用组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增加这些位点的乙酰化，有利于提高肿瘤临床治疗的敏感性[17]。然而Ku70的K317和K331以及上边所提到的K282和K338都位于Ku70的DNA粘附结构域内，但是前两者的乙酰化对Ku70的粘附活性并没有明显的影响，它们的乙酰化可能参与Ku70的其他功能，需要进一步探究[17]。在Ku70的核定位信号结构域内，存在5 个乙酰化位点（K539，K542，K544，K553 和 K556）（图1），当肿瘤细胞发生DNA损伤后，这些位点的乙酰化可能促进细胞质内的Ku70的入核，参与到DNA损伤修复中，提高肿瘤细胞抗损伤修复的能力[18]。

细胞质内Ku70的乙酰化在Bax介导的线粒体凋亡中发挥着重要作用。Bax是一个促凋亡蛋白，属于BCL-2家族蛋白成员，在线粒体凋亡通路中，起着关键性作用[19]。当肿瘤细胞受到凋亡刺激时Bax被激活，活化的Bax发生一系列构象的改变，逐渐聚集到线粒体，在线粒体外膜形成二聚体，或者进一步聚集形成多聚体，最终引起线粒体释放细胞色素c，诱导细胞的凋亡[20]。但是当细胞在正常生理状态下，细胞中存在某些蛋白可以和Bax结合，从而维持Bax处于失活状态[21]。Ku70是第一个被发现可以结合Bax，阻止其向线粒体转移的蛋白，而且Ku70的乙酰化状态和去乙酰化状态调节着Bax的激活和失活状态[22]。当Ku70处于去乙酰化状态时，就和Bax结合，形成复合体，稳定存在于细胞质中；而Ku70被某些乙酰化酶催化发生乙酰化后，两者就会分离，引起Bax激活，从而引起细胞凋亡[22]。近几年来，研究表明Ku70可以被CBP（the CREB-binding protein，CREB 结合蛋白）或 PCAF（p300/CBP-assoc iated factor,p300/CBP相关因子）乙酰化，在肿瘤细胞中高表达CBP可以增加Ku70的乙酰化，相反低表达CBP可以降低Ku70的乙酰化[3，23]。K539和K542位点（图1）在CBP或PCAF介导的Ku70的乙酰化中起关键作用，研究者突变两个位点的赖氨酸（K539QandK542Q），发现完全抑制了Ku70在细胞质中阻止Bax介导线粒体凋亡的能力[22，24]。细胞质内Ku70蛋白的乙酰化水平也受到组蛋白去乙酰化酶的调节（HDACs），到目前为止，SIRT1[25]、SIRT3[26]和HDAC6[3]已经被证实可以去乙酰化Ku70，从而减少Bax介导的细胞凋亡，当敲低它们的表达或者用特异性的抑制剂能够增加Ku70的乙酰化，从而增加了Bax介导的细胞凋亡。因此，近几年来Ku70的组蛋白去乙酰化酶成为肿瘤的治疗过程中新靶点[17,27-28]。

1.3 泛素化和SUMO类泛素化修饰 泛素化也是一种常见的翻译后修饰，几乎所有的蛋白都会经历泛素化修饰。当蛋白受到损伤，发生错误折叠，或者不再被机体所需要，这些蛋白就会发生泛素化修饰[29]。以前认为蛋白的泛素化最终结局是运输到蛋白酶体后降解，现在随着认识的深入，发现蛋白的泛素化不仅只是标识着蛋白的降解，对于蛋白的运输以及功能也有很重要的影响。研究表明，在非同源末端连接修复后期，RNF126或者SCF复合体可以使Ku70泛素化，从而使Ku70从DNA上脱离下来，有利于修复的进一步完成[30-31]。最近一项研究发现Ku70 的 vWF（the von Willebrand factor）结构域包含一个泛素化位点（K114）（图 1，表 1）,此位点的泛素化介导了Ku70以及其他非同源末端连接修复因子与DNA双链的脱离[32]。Ku70和Ku80结合的时候，两者更加稳定，当其中任何一种蛋白经泛素化降解都不利于形成一个稳定的Ku蛋白，因此泛素化直接或间接对Ku70蛋白的稳定性产生影响。目前Ku70蛋白的泛素化还需要进一步探究，具体泛素化位点还需要进一步确定，这将会深入认识Ku70泛素化的具体作用，为肿瘤的研究提供新的认识。

SUMO（small ubiquitin-related modifier）是一类重要的类泛素蛋白，在类泛素化E2结合酶Ubc9以及E3连接酶的共同作用下，连接到蛋白上，参与调节蛋白的稳定性以及胞内定位等生物学功能[33]。在哺乳动物中，目前发现至少存在4种SUMO分子，包括SUMO-1，-2，-3和-4[34]。随着对SUMO类泛素化研究的深入，越来越多的研究表明，SUMO类泛素化修饰在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色。研究发现，在人类卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌以及结直肠癌等肿瘤细胞中，类泛素化E2结合酶以及E3连接酶存在不同程度的高表达[35]，另外许多肿瘤相关蛋白如P53、P63以及pRB等也存在着SUMO类泛素化的修饰。因此进一步明确SUMO类泛素化的生物学功能特点，对肿瘤的治疗具有重要意义。近几年来，相关研究表明细胞内高水平的SUMO-1或SUMO-2使Ku70蛋白更加稳定，Ku70的稳定性直接增加了Ku70在细胞中的表达水平，而Ku70蛋白自身的SUMO类泛素化修饰却没有对其稳定性产生明显影响[36]。而在真核单细胞芽殖酵母中的一项研究表明，Ku70蛋白的5个赖氨酸位点（K588、K591、K592、K596、K597） 突变为精氨酸后，Ku70蛋白的SUMO类泛素化明显下调，进而减弱了Ku70在非同源末端连接中的功能[37]。SUMO类泛素化修饰对Ku70稳定性以及功能的影响需要进一步研究。

1.4 其他修饰 Ku70的功能的多样性，与其翻译后修饰密切相关。目前，Ku70蛋白的翻译后修饰主要集中在以上所述的修饰类型，而其他修饰类型有待深入研究，例如蛋白的糖基化可以影响蛋白在核内和质内的分布；也可以改变蛋白的构象，从而影响蛋白与蛋白，蛋白与DNA的相互作用[38]。目前的研究表明，Ku70的ADP-核糖基化作为Ku70蛋白的募集信号，在DNA双链断裂非同源末端连接修复中发挥着重要作用[39]。ADP-核糖基化酶可以与Ku70蛋白的锌指结构域结合，从而增强Ku70蛋白和DNA的结合作用，促进非同源末端连接修复的进行[40]。在肿瘤的研究过程中，Ku70的这种糖基化修饰在其他功能方面发挥的作用还不清楚，需要进一步探究,这将为肿瘤的防治提供新思路。

2 结语

近几年来，随着对肿瘤研究的不断深入，Ku70在肿瘤细胞胞质和核内的功能逐渐被阐明。Ku70除了在DNA双链断裂的非同源末端连接修复、Bax参与的细胞凋亡、端粒的维持以及DNA复制等方面发挥着重要作用外，Ku70本身还具有酶活性，例如Ku70的去泛素化酶活性[41]，Ku70蛋白的其他功能还需要深入研究。Ku70功能的多样性与翻译后修饰密切相关,本篇综述了Ku70的翻译后修饰在肿瘤研究中的进展情况，表明Ku70的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO类泛素化等在Ku70相关信号通路中发挥着至关重要的作用。因此，针对Ku70蛋白及其翻译后修饰为靶点的肿瘤治疗，比如Ku70蛋白的抑制剂及其翻译后修饰抑制剂或者激活剂有望增加肿瘤的治疗效果。进一步研究Ku70蛋白及其翻译后修饰，具体的修饰类型和位点，Ku70蛋白翻译后修饰的功能改变等，对肿瘤的发生与治疗有重要意义。